李 敏， 林思思， 沈 利， 張瑞琴， 李永渝

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，消化系統(tǒng)疾病研究所，上海 200092； 2. 遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校生理教研室，貴州 遵義 563000；3. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，上海 200092)

?

·基礎(chǔ)研究·

新型大麻制劑O-1602對(duì)急性胰腺炎小鼠腸道免疫及菌群的影響

李 敏1，2， 林思思1， 沈 利3， 張瑞琴1， 李永渝1

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，消化系統(tǒng)疾病研究所，上海 200092； 2. 遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校生理教研室，貴州 遵義 563000；
3. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，上海 200092)

目的 研究新型大麻制劑O-1602對(duì)急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)小鼠腸道免疫及菌群紊亂的干預(yù)作用。方法 成年C57/BL6小鼠21只，雌雄各半，隨機(jī)均分為AP模型組(AP組，n=7)、AP治療組(AP+ O-1602組，n=7)及正常對(duì)照組(control組，n=7)。AP模型組、AP治療組以雨蛙肽腹腔注射(50μg/kg)復(fù)制AP模型，并分別給以腹腔注射藥物溶劑或O-1602溶液(10mg/kg)；正常對(duì)照組小鼠用相同方式獲得等量生理鹽水及藥物溶劑注射。3組動(dòng)物均于末次注藥3h后麻醉處死，收集其血液、小腸和結(jié)腸及腸道Peyer’s結(jié)。檢測(cè)和分析腸道細(xì)菌總數(shù)和主要類別、Peyer’s結(jié)中T淋巴細(xì)胞及其亞群的變化；檢測(cè)血漿淀粉酶及細(xì)胞因子IL-10、MCP-1水平的變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，AP小鼠腸道細(xì)菌總數(shù)、主要亞群，尤其是大腸桿菌、腸球菌的數(shù)量、血漿淀粉酶活性、IL-10 及MCP-1水平都有明顯升高(P<0.05 或P<0.01)；新型大麻制劑O-1602可在一定程度上逆轉(zhuǎn)AP時(shí)的上述異常變化(P<0.05)。各組腸道Peyer’s結(jié)數(shù)量無(wú)明顯差異，但AP小鼠Peyer’s結(jié)中CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯降低(AP組P<0.01,AP+O-1602組P<0.05)，CD4+/CD8+較對(duì)照組也有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 O-1602對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎具有一定拮抗作用，其機(jī)制可能與其促進(jìn)腸道細(xì)菌的清除、調(diào)節(jié)腸道T淋巴細(xì)胞功能、抑制炎癥反應(yīng)等有關(guān)。

急性胰腺炎； 大麻制劑O-1602； 腸道菌群； Peyer’s結(jié)； T淋巴細(xì)胞； 小鼠

急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)是臨床上常見(jiàn)疾病，其發(fā)病機(jī)制目前還不完全清楚。約1/3的AP患者病情會(huì)加重而并發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome， SIRS)及多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome， MODS)[1]。研究[2-3]表明，在AP的病程演變以及繼發(fā)MODS和SIRS的過(guò)程中，促炎細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)起了重要作用，而這些變化與腸道屏障功能紊亂密切相關(guān)。臨床上，針對(duì)AP的治療對(duì)策也隨著對(duì)AP發(fā)病機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)而不斷改善。

經(jīng)典大麻類物質(zhì)對(duì)腸道炎性疾病的治療已有很多報(bào)道，但由于其明顯的副作用及成癮問(wèn)題使其應(yīng)用受到限制。新型大麻制劑O-1602是一種G蛋白耦聯(lián)受體GPR55(G protein-coupled receptor 55)的激動(dòng)劑，能特異性激活GPR55，而對(duì)經(jīng)典的大麻素受體CB1和CB2無(wú)作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的副作用很小。研究[4-6]表明，O-1602可以通過(guò)已知的大麻素抗炎機(jī)制減輕AP的病變程度，本研究是繼之前研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索O-1602對(duì)AP時(shí)腸道免疫功能以及對(duì)腸道菌群的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年C57/BL6小鼠21只，體質(zhì)量為18～26g，雌雄各半，購(gòu)自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物在溫度為(25±2)℃、濕度(55±5)%的環(huán)境下喂養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)飲食。

1.2 主要試劑和儀器

雨蛙肽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；O-1602購(gòu)自Biotrend公司；淀粉酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)公司；Elx800酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；BD FACSVerse流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 急性胰腺炎小鼠模型復(fù)制及分組處理 取C57/BL6小鼠21只，隨機(jī)均分為3組： 正常對(duì)照組(control)、急性胰腺炎組(AP組)，急性胰腺炎+新型大麻制劑O-1602組(AP+O-1602組)。各組小鼠自由飲水條件下禁食12h后接受實(shí)驗(yàn)。參照馮佳燕等[5]、Li等[6]介紹的方法，用雨蛙肽腹腔注射復(fù)制小鼠AP模型。具體操作方法如下： 給小鼠腹腔注射雨蛙肽(50μg/kg)，每小時(shí)1次，連續(xù)注射6次。在第1次雨蛙肽注射前0.5h及注射后5h按10ml/kg體質(zhì)量經(jīng)腹腔給小鼠注射藥物溶劑(AP組)或1mg/ml濃度的新型大麻制劑O-1602(AP+O-1602組)。正常對(duì)照組小鼠獲得相同次數(shù)和劑量的生理鹽水及溶劑行腹腔注射。于末次注射后3h麻醉處死小鼠，取腸組織、腸道Peyer’s結(jié)及血液。

1.3.2 血漿淀粉酶活性 血液抗凝，4℃，離心半徑5cm，4000r/min，離心10min，取上清液。血漿淀粉酶(amylase)活性按照淀粉酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以對(duì)照組的值為100%，AP組和AP+O-1602組的值分別以占對(duì)照組的百分比來(lái)表示。

1.3.3 血漿炎癥介質(zhì)水平 用ELISA試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書的方法分別檢測(cè)血漿IL-10和MCP-1水平，結(jié)果以pg/ml表示。

1.3.4 腸菌檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7]的方法，在距盲腸上下1cm左右取回腸和結(jié)腸各1cm，稱取質(zhì)量，用LB液沖洗腸壁，分別用麥康凱，膽鹽-七葉苷-疊氮鈉，BBL以及血瓊脂平板選擇性培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及總細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，于有氧或厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果以組織樣品中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)(cfu/mg)來(lái)表示。

1.3.5 小腸Peyer’s結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取小腸全段，記錄Peyer’s結(jié)數(shù)量并摘取之，參照文獻(xiàn)[7]的方法，用流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，檢測(cè)各組小鼠小腸Peyer’s結(jié)中CD3+占T淋巴細(xì)胞的百分比以及CD4+、CD8+占CD3+T淋巴細(xì)胞的百分比，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血漿淀粉酶活性的變化

血漿淀粉酶的檢測(cè)結(jié)果顯示，AP組小鼠血漿淀粉酶活性較正常小鼠的明顯升高(P<0.01)；新型大麻制劑O-1602治療可明顯降低血漿胰酶的活性(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 新型大麻制劑O-1602對(duì)AP小鼠血漿淀粉酶活性的影響Fig.1 Effects of O-1602 on amylase level in plasma from mice with AP與對(duì)照組相比，**P<0.01；與AP組相比，#P<0.05

2.2 血漿炎癥介質(zhì)水平的變化

與對(duì)照組相比，AP組小鼠血漿中的化學(xué)趨化因子MCP-1水平明顯增高(P<0.01)，見(jiàn)圖2A；O-1602治療組的MCP-1血漿水平雖仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)，但較AP組的明顯降低(P<0.05)。AP組IL-10 高于對(duì)照組，與O-1602治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2B。

圖2 新型大麻制劑O-1602對(duì)AP小鼠血漿炎癥介質(zhì)水平的影響Fig.2 Effects of O-1602 on levels of inflammatory mediators in the plasma of mice with APA： MCP-1水平； B： IL-10水平；與對(duì)照組相比，**P<0.01；與AP組相比，#P<0.05

2.3 腸道菌群的變化

與對(duì)照組相比，AP組小鼠回腸、結(jié)腸中的大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌以及總細(xì)菌數(shù)都明顯增多，其中以大腸桿菌和腸球菌的增多更為明顯(P<0.05)。新型大麻制劑O-1602干預(yù)后，回腸益生菌雙歧桿菌增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各類致病菌或條件致病細(xì)菌較AP組都有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明新型大麻制劑O-1602對(duì)腸道細(xì)菌的影響是有利的，見(jiàn)表1。

表1 新型大麻制劑O-1602對(duì)急性胰腺炎小鼠腸道菌群的影響

與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.4 小腸Peyer’s結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的改變

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AP組的CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)，AP+O-1602組也有明顯降低(P<0.05)，但較AP組有所提升。將各組CD3+細(xì)胞再分類，得到亞群CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞所占百分比以及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值。與對(duì)照組比較，AP組CD4+T淋巴細(xì)胞所占比例明顯降低(P<0.01)，AP+O-1602組雖然與對(duì)照組相比也有明顯降低，但較AP組是有所增高的。CD4+/CD8+比值的變化趨勢(shì)同CD4+T淋巴細(xì)胞變化相似，見(jiàn)圖3、表2。提示新型大麻制劑O-1602可一定程度上提高胰腺炎小鼠小腸Peyer’s結(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞，改善腸道免疫功能。

圖3 腸道peyer’s CD3+淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的變化(流式代表圖)Fig.3 Changes of CD3+ T lymphocyte percentage in the intestinal Peyer’s patches from mice with acute pancreatitis(representative figures captured from flow cytometry measurement)A： 對(duì)照組；B： AP組；C： AP+O-1602組

表2 腸道Peyer’s T淋巴細(xì)胞亞群的變化

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與對(duì)照組相比，**P<0.01

3 討 論

AP可由多種病因引起，例如膽道梗阻、酒精中毒、高脂血癥、高鈣血癥、創(chuàng)傷，等等。在我國(guó)多以各種膽道疾患引起的膽源性胰腺炎為主[8]。因此，AP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。已有的觀點(diǎn)認(rèn)為： 由于病因的作用，使胰酶胞內(nèi)激活、炎癥介質(zhì)過(guò)度產(chǎn)生、微循環(huán)紊亂、腸屏障功能障礙等，造成胰腺局部乃至遠(yuǎn)隔器官的損傷是AP發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)存在兩種經(jīng)典的大麻素受體，CB1受體和CB2受體。這兩種受體有44%的氨基酸序列同源，都是7次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體，相對(duì)分子量約為52800。隨著對(duì)大麻素系統(tǒng)研究的深入，另一種大麻受體GPR55在哺乳類被發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為可能是第3種CB受體。它存在于人腦與控制記憶、學(xué)習(xí)和運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)的區(qū)域(背側(cè)紋狀體、尾狀核和殼)，進(jìn)而在胰腺、回腸、脾、扁桃體、乳房等周圍組織也發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)[6，10-12]。大麻類物質(zhì)，不論外源性或內(nèi)源性，可選擇性地與這些受體結(jié)合而發(fā)揮多種生理功能。研究[10-11，13]表明，對(duì)于消化系統(tǒng)，大麻類物質(zhì)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)等作用。新型大麻類制劑O-1602是GPR55的激動(dòng)劑，是非精神作用的大麻類，能特異激活GPR55。前期實(shí)驗(yàn)[5-6]發(fā)現(xiàn)，用雨蛙肽誘導(dǎo)小鼠AP模型，同時(shí)給予O-1602干預(yù)，胰腺局部炎癥及損傷有所改善，血漿淀粉酶、脂肪酶活性，以及促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 水平明顯下降；肺、腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)中髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性明顯降低。提示O-1602有抗炎和保護(hù)組織的作用。

本實(shí)驗(yàn)用經(jīng)典方法即腹腔注射大劑量促胰酶分泌劑雨蛙肽(膽囊收縮素的類似物)復(fù)制小鼠AP模型，造模后的小鼠血漿淀粉酶及炎癥介質(zhì)MCP-1水平顯著增高；O-1602干預(yù)可明顯拮抗這些變化，與本課題組前期實(shí)驗(yàn)所見(jiàn)相似。本研究發(fā)現(xiàn)，AP小鼠腸道菌群繁殖加快，腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，其發(fā)生可能是由于AP時(shí)腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂，腸內(nèi)容物排出受阻而淤積于腸道所致；這些變化可為細(xì)菌及毒素移位創(chuàng)造條件[14]，一旦出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，炎癥細(xì)胞進(jìn)一步活化，促炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)大量產(chǎn)生和釋放，又會(huì)對(duì)胰腺等組織器官造成第2次打擊，并且可能誘發(fā)多臟器功能衰竭。

Peyer’s結(jié)主要存在于回腸部位，是小腸黏膜內(nèi)的一組淋巴濾泡，是腸黏膜免疫屏障中的重要組成部分。該淋巴濾泡主要由B細(xì)胞和T細(xì)胞(CD4為主)組成，在其表面覆蓋著一層M細(xì)胞，能識(shí)別胃腸道內(nèi)呈現(xiàn)的多種抗原，主要吞噬病毒和腸道病原菌，進(jìn)而提呈吞入的抗原轉(zhuǎn)交給免疫細(xì)胞；后者對(duì)提呈的致病抗原進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，并在此過(guò)程中被激活。激活的免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)循環(huán)歸巢的過(guò)程回到腸黏膜固有層，成為分泌IgA為主的漿細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞，參與腸道局部免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果揭示，AP時(shí)腸道Peyer’s結(jié)CD3、CD4淋巴細(xì)胞比例及CD4/CD8比值較正常對(duì)照組均有下降，提示T淋巴細(xì)胞功能降低，腸道免疫屏障受到影響。腸屏障功能的受損，可進(jìn)一步促進(jìn)腸道細(xì)菌及毒素的移位，形成AP病程中的因果轉(zhuǎn)化和惡性循環(huán)。因此，保護(hù)腸道屏障功能，減少細(xì)菌移位和減輕內(nèi)毒素血癥，是AP治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用O-1602干預(yù)，可促進(jìn)益生菌的繁殖，一定程度上抑制AP小鼠腸道致病細(xì)菌的過(guò)度生長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)小腸Peyer’s結(jié)中T淋巴細(xì)胞及其亞群比例的變化。結(jié)果提示，O-1602能減輕AP時(shí)機(jī)體的病理生理變化，其可能的作用機(jī)制包括： (1) 下調(diào)血漿炎癥介質(zhì)的水平，進(jìn)而阻斷由其觸發(fā)的一系列炎癥連鎖反應(yīng)；(2) 促進(jìn)腸內(nèi)有害細(xì)菌的清除，其機(jī)制可能與其他大麻類物質(zhì)一樣，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能，促進(jìn)腸內(nèi)細(xì)菌和毒物的排泄；(3) 改善腸道免疫屏障功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)新型大麻制劑O-1602對(duì)急性胰腺炎具有一定拮抗作用，其作用機(jī)制與O-1602抑制炎癥反應(yīng)、抑制腸道有害細(xì)菌的繁殖、調(diào)節(jié)腸道T淋巴細(xì)胞功能等有關(guān)。其中作用的具體環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步的研究。

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Effect of a novel cannabis preparation O-1602 on intestinal immunity and microflora in mice with acute pancreatitis

LIMin1，2，LINSi-si1，SHENLi3，ZHANGRui-qin1，LIYong-yu1

(1. Dept. of Pathophysiology， Institute of Digestive Disease， Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China； 2. Dept. of Physiology， Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi 563000， Guizhou Province, China； 3. Dept. of Pathogen Biology， Medical College， Tongji University ， Shanghai 200092， China)

Objective To investigate effect of a novel cannabis preparation O-1602 on the intestinal immunity and microflora in mice with acute pancreatitis(AP). Methods Twenty one adult C57/BL6 mice were randomly divided into three group： normal control group(control，n=7)， AP group(n=7)， and O-1602 treated group(AP+O-1602，n=7). AP was induced by intraperitoneal injection of caerulein(50μg /kg). Drug vehicle or O-1602(10mg/kg) was given intraperitoneal injection to AP group or AP+O-1602 group respectively, and equivalent volume of normal saline and drug vehicle was given to the control group. The mice were sacrificed at 3h after the last injection， and the blood， the whole small intestine and colon， the intestinal Peyer’s patches were harvested. The microflora in the ileum and colon were examined； the T lymphocytes and its subgroups in the Peyer’s patches were determined. The plasma levels of amylase， interleukin-10(IL-10) and monocyte chemotactic protein 1(MCP-1) were measured. Results Compared to the control group， mice in AP group presented with significantly increased intestinal microflora， plasma amylase activity and levels of IL-10 and MCP-1 (P<0.05 orP<0.01). O-1602 attenuated these changes to some extent(P<0.05). There was no significant difference in the numbers of Peyer’s patches in the intestine among the three groups； but the percentage of CD3+， CD4+T lymphocyte decreased significantly in AP group and AP+O-1602 group(P<0.01 andP<0.05, respectively)， and an indistinctively decreased percentage of CD4+/ CD8+was observed. Conclusion O-1602 protects mice from cearulein-induced acute pancreatitis， which may be related to suppressing inflammatory response， promoting bacteria removal， and regulating T lymphocyte function in intestinal barrier.

acute pancreatitis； cannabis preparation O-1602； intestinal microflora； Peyer’s patches； T lymphocytes； mice

10.16118/j.1008-0392.2016.05.001

2016-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270477、31571181)

李 敏(1987—)，女，助教，學(xué)士.E-mail： 327814831@qq.com

李永渝.E-mail： liyongyu@#edu.cn

R 576

A

1008-0392(2016)05-0001-05