張 瑩， 王 璐， 劉利敏， 張 穎， 石 靜， 林 清

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院腫瘤放射治療科，上海 200072； 2. 上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科，上海 201999)

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·基礎(chǔ)研究·

X射線對人三陰性乳腺癌細胞E-鈣黏蛋白基因表達的影響

張 瑩1， 王 璐1， 劉利敏2， 張 穎1， 石 靜1， 林 清1

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院腫瘤放射治療科，上海 200072； 2. 上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科，上海 201999)

目的 研究不同劑量X射線照射人三陰性乳腺癌細胞，照射后不同時間點對人三陰性乳腺癌細胞E-鈣黏蛋白(E-cadherin)基因表達的影響。方法 用X射線分2.5、5和10Gy 3個吸收劑量組照射體外培養(yǎng)的人三陰性乳腺癌HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞，采用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞經(jīng)照射后6、12、24和48h的E-cadherin mRNA表達水平，以未照射組(0h組)為對照。結(jié)果 HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞E-cadherin mRNA的表達在2.5、5、10Gy X射線照射后，隨著時間點的后移呈升高趨勢。與未照射組相比，除了HCC1937細胞10Gy照射后6h、2.5Gy和5Gy照射后24h及MDA-MB-231細胞 5Gy 照射后12h外，各時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HCC1937細胞在2.5Gy和10Gy照射后48h，E-cadherin mRNA的表達呈下降趨勢，與未照射組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 較大劑量的X射線整體可上調(diào)HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞E-cadherin mRNA的表達，可能誘導了腫瘤細胞凋亡；晚期HCC1937細胞E-cadherin mRNA的表達下降，可能與輻射所致HCC1937細胞的放射生物學效應有關(guān)。

三陰性乳腺腫瘤； E-鈣黏蛋白； HCC1937細胞； MDA-MB-231細胞； X射線； 照射

三陰性乳腺癌(three negative breast cancer， TNBC)是雌激素受體(estrogen receptor， ER)、孕激素受體(progesterone receptor， PR)、原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2， HER2)均陰性表達的乳腺癌亞型，在所有乳腺癌中占15%～26%[1-2]。三陰性乳腺癌的5年復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移率(30.8%)明顯高于非三陰性(18.7%，P<0.05)，三陰性乳腺癌的5年總生存率(78.4%)明顯低于非三陰性(88.1%，P<0.05)[3]。由于TNBC分化差、組織學分級高，因此臨床上容易發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移，預后不良。目前TNBC尚缺乏特異性的治療靶點，不能從內(nèi)分泌治療及分子靶向治療中獲益，因此尋找有效的治療靶點是TNBC治療的關(guān)鍵。研究[4]發(fā)現(xiàn)，約70%的原發(fā)性乳腺腫瘤中存在E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達減少甚至缺失，E-cadherin下調(diào)是上皮間質(zhì)化的標志，正是由于E-cadherin的功能缺失導致細胞與細胞之間的黏附力下降，促使上皮間質(zhì)化的發(fā)生，進而引起腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究探討X線輻射對E-cadherin mRNA的表達的影響，從而分析放療對乳腺癌尤其是TNBC的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

HCC1937細胞株和MDA-MB-231細胞株購自中科院上海細胞庫，為同濟大學附屬第十人民醫(yī)院醫(yī)院中心實驗室常規(guī)保存；RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent Kit試劑盒購自TaKaRa公司；SYBR FAST qPCR Master Mix試劑盒購自KAPA公司;E-cadherin引物、內(nèi)參(β-Actin)引物均由上海華大基因研究所合成。

1.2 細胞培養(yǎng)和照射條件

HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞在37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞，常溫下以直線加速器(Elekta公司，型號： Precise)X射線(能量： 6MV，SSD： 100cm)進行照射，劑量率450cGy/min，吸收劑量分別為2.5、5和10Gy，照射后分別繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24和 48h。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成 按TRIzol說明書提取細胞總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，反應條件： 37℃，15min；85℃，5s。

1.3.2 RT-PCR檢測 E-cadherin上游引物序列為5′-TGCCAAGTGGGTGGTATAGAGG-3′，下游為5′-CAGTGGGATGGTGGGTGTAAGA-3′，擴增片段長度約126bp。β-Actin上游： 5′-GCACCACACC-TTCTACAATGA-3′；下游： 5′-TGTCACGCACGA-TTTCCC-3′，大小377bp。取2μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進行RT-PCR檢測，程序設(shè)置如下： 95℃，3min；95℃，3s；60℃，30s；40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR法的特異性

熔解度曲線分析顯示，目的基因E-cadherin及內(nèi)參β-Actin的熔解曲線均成單一峰，熔解溫度均一，峰形銳利。反應曲線的其他位置未見到波形，結(jié)合Tm值分析提示PCR產(chǎn)物為特異性產(chǎn)物，可以進行結(jié)果分析(圖1)。

圖1 熔解度曲線分析PCR產(chǎn)物特異性Fig.1 Melting curve analysis of PCR product specificity

2.2 E-cadherin mRNA相對表達量

以0h組E-cadherinm RNA的表達量為1，E-cadherin基因的相對表達量的結(jié)果見表1。與0h組相比，E-cadherinm RNA的表達在2.5、5、10Gy各劑量組(除了HCC1937細胞10Gy照射后6h、2.5Gy和5Gy照射后24h及MDA-MB-231細胞5Gy照射后12h外)照射后均呈升高趨勢，但HCC1937細胞在2.5Gy和10Gy照射后48h，E-cadherin mRNA的表達呈下降趨勢，見表1～2。

表1 不同劑量X射線照射HCC1937細胞后不同時間點E-cadherin mRNA相對表達量

照射后時間/h2.5Gy5Gy10Gy01.00±0.001.00±0.001.00±0.0061.30±0.09a1.13±0.05a0.85±0.04121.22±0.08a2.27±0.24a0.92±0.01a241.35±0.151.62±0.311.82±0.09a480.67±0.09a0.77±0.120.09±0.03a

表示與0h組相比，aP<0.05

表2 不同劑量X射線照射MDA-MB-231細胞后不同時間點E-cadherin mRNA相對表達量

照射后時間/h2.5Gy5Gy10Gy01.00±0.001.00±0.001.00±0.0060.19±0.03a0.70±0.02a1.47±0.14a121.20±0.23a1.03±0.061.27±0.11a241.18±0.28a1.22±0.17a1.34±0.17a481.25±0.031.36±0.04a1.11±0.13

表示與0h組相比，aP<0.05

3 討 論

E-cadherin是一種細胞黏附分子，屬于鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，具有維持組織結(jié)構(gòu)的完整性等作用[5]，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[4]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)時，E-cadherin表達下降或功能缺失，細胞間黏附力下降、極性丟失，向周圍組織浸潤生長，并可脫離癌灶發(fā)生轉(zhuǎn)移。已經(jīng)有研究[8]表明E-cadherin表達缺失與TNBC容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，E-cadherin在三陰性乳腺癌的發(fā)展過程中起著重要作用，可以作為三陰性乳腺癌患者預后的一個重要的獨立預測因素。鄧淼等[9]研究表明乳腺癌組織中E-cadherin與HER-2、ER及PR呈正相關(guān)，因此TNBC中E-cadherin表達缺失達48.7%，遠高于其他兩種分子分型；因E-cadherin表達缺失，TNBC發(fā)生EMT，易通過淋巴道侵襲及向其他臟器轉(zhuǎn)移，臨床預后差。

目前，研究主要集中在E-cadherin與TNBC臨床病理參數(shù)的關(guān)系及與TNBC的預后等方面，關(guān)于E-cadherin與TNBC治療方面的研究報道甚少。關(guān)于E-cadherin與TNBC治療的研究有望成為TNBC靶向治療新的突破口。由于E-cadherin在乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移中的重要作用，重新恢復E-cadherin的表達能夠抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。目前尚無針對E-cadherin通路的特異性藥物來誘導E-cadherin基因的表達，因此在TNBC中系統(tǒng)深入地研究E-cadherin通路，研制特異性上調(diào)E-cadherin表達的方法具有積極的意義。

放射治療是乳腺癌綜合治療重要手段之一，對于X線照射能否上調(diào)E-cadherin的表達鮮有報道，乳腺癌在放療過程中，腫瘤細胞的凋亡和DNA損傷修復是由多基因調(diào)控的，其過程復雜，而E-cadherin是否參與了這個復雜的基因調(diào)控，或者放療是否可以影響E-cadherin的表達是非常值得探究的。本研究顯示： 與 0h 組相比，E-cadherin mRNA的表達在2.5、5、10Gy X射線照射后的早期呈升高趨勢，但HCC1937細胞在晚期呈下降趨勢，大部分時間點差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究顯示： 較大劑量的X射線在早期可上調(diào)HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞E-cadherinm RNA的表達，抑制大部分腫瘤細胞發(fā)生EMT，表明放射治療對于減少TNBC發(fā)生EMT確實有效；而在晚期，隨著HCC1937細胞凋亡比率的增加，腫瘤細胞為了抗拒射線帶來的損傷可能啟動部分調(diào)控基因來阻抑凋亡的繼續(xù)發(fā)生，通過某種途徑使得E-cadherin mRNA的表達得以回落，比如經(jīng)典的放射生物學4“R”，即細胞的修復，再增殖，再氧化，細胞周期的再分布，并且細胞能在受照后1h就出現(xiàn)亞致死損傷修復及潛在致死性損傷修復，從而可能調(diào)動了細胞的DNA損傷修復反應和細胞周期調(diào)控，阻抑了部分HCC1937細胞繼續(xù)凋亡，使部分HCC1937細胞產(chǎn)生輻射抗性(由于觀察節(jié)點選定于細胞受照射后48h，可能MDA-MB-231細胞尚未表現(xiàn)出上述現(xiàn)象)。因此，可以根據(jù)電離輻射對E-cadherin mRNA的表達的影響進一步探討TNBC患者相對于其他類型的乳腺癌是否更能從放療中獲益，大分割劑量可能更優(yōu)于常規(guī)分割劑量，重新調(diào)控二次放療的間隔時間，從而制定個體化治療方案。

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Effect of X-ray on E-cadherin gene expression in human triple negative breast cancer cells

ZHANGYing1，WANGLu1，LIULi-min2，ZHANGYing1，SHIJing1，LINQing1

(1. Dept. of Tumor Radiotherapy， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China；2. Dept. General Surgery， Shanghai Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine with Western Medicine， Shanghai 201999， China)

Objective To investigate the effects of different doses of X-ray irradiation on the expression of E-cadherin gene in triple negative breast cancer cells. Methods Human triple negative breast cancer MDA-MB-231 and HCC1937 cells were exposed to X-ray Irradiation at a dose of 2.5， 5 and 10Gy for 6， 12， 24 and 48h， respectively. E-cadherin mRNA expression levels in HCC1937 and MDA-MB-231 cells after irradiation were detected with fluorescence real-time PCR technology. Results E-cadherin mRNA expression levels in HCC1937 and MDA-MB-231 cells after irradiation were raised with exposure time. Except HCC1937 cell 6h after 10Gy， 2.5Gy irradiation and 24h after 5Gy irradiation， MDA- MB-231 cells 12h after 5Gy irradiation， there were significant differences at all time points between irradiation and non-irradiation groups(P<0.05). E-cadherin mRNA expression of HCC1937 cells was decreased 48h after 2.5Gy and 10Gy irradiation， compared with those of the non- irradiation group(P< 0.05). Conclusion High dose of X-rays irradiation may upgrade the expression of E-cadherin mRNA in human HCC1937 and MDA-MB-231cells， resulting in cell apoptosis. The decreased expression of E-cadherin mRNA in HCC1937 cells after long exposure to X-ray irradiation might be associated with the biological effect of radiation.

three negative breast cancer； E-cadherin； HCC1937 cell; MDA-MB-231 cell； X beam； illumination

10.16118/j.1008-0392.2016.05.005

2016-04-11

張 瑩(1969—)，女，副主任醫(yī)師，學士.E-mail： shiyuanzhangying@163.com

林 清.E-mail： linqing.linda@163.com

R 737.9

A

1008-0392(2016)05-0025-04