周仁蘭，謝鵬，王楨，劉林

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大鼠腦出血后血腫周圍腦水腫與Mip1表達(dá)的關(guān)系

周仁蘭1，謝鵬2，王楨2，劉林2

目的通過分析大鼠腦出血（ICH）后血腫周圍腦組織中Mip1的表達(dá)，探索Mip1對腦水腫的保護(hù)作用。方法90只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=15）和ICH組（n=75），ICH組再根據(jù)造模后腦出血時間均分為ICH 6 h、12 h、1 d、3 d和7 d組。應(yīng)用自體股動脈血液建立大鼠尾狀核腦出血模型。于上述時點斷頭處死大鼠，取血腫周圍腦組織。采用HE染色觀察血腫周圍腦組織病理形態(tài)學(xué)變化，干/濕質(zhì)量法測定腦含水量（BWC），免疫組化法檢測Mip1蛋白的表達(dá)。結(jié)果腦出血后血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元胞體明顯變小，胞漿淡染，胞質(zhì)內(nèi)尼氏體明顯減少，細(xì)胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙，而假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化。腦出血6 h后腦含水量逐漸增高，在3 d時達(dá)高峰（均P＜0.05），7 d時大致恢復(fù)正常（P＞0.05）。大鼠腦出血后腦組織血腫周圍有大量胞質(zhì)或胞核呈棕色的Mip1陽性細(xì)胞分布，腦出血6 h后Mip1蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高（均P＜0.05），至7 d時大致恢復(fù)正常（P＞0.05）。結(jié)論腦出血后血腫周圍腦組織中Mip1高表達(dá)，并與腦水腫進(jìn)展趨勢基本一致，提示活化的Mip1可能參與出血性腦水腫的病理過程。

腦出血；腦水腫；大鼠，Sprague-Dawley；腦含水量；Mip1

腦出血（ICH）是致命和難治的中風(fēng)［1-2］，發(fā)病率為每年（10～30）例/10萬，死亡率為30%～50%［3］，目前尚無有效的治療方法［4］。自發(fā)腦出血急性期由于持續(xù)出血和血腫擴(kuò)張，導(dǎo)致病死率較高［5-6］。另外，腦出血繼發(fā)性損傷也會導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率顯著升高，炎癥級聯(lián)反應(yīng)是繼發(fā)性損傷機(jī)制的主要元兇［1］，腦出血后炎癥損傷等因素導(dǎo)致腦水腫形成，使得病情進(jìn)一步加重，因此，減輕腦水腫是腦出血臨床治療的關(guān)鍵［7］。有研究顯示細(xì)胞保護(hù)蛋白Mip1參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)化，在腦組織中表達(dá)較高，其次是在心臟，在其他組織中表達(dá)較低或無表達(dá)［8］。目前尚少見有關(guān)Mip1在腦出血后腦組織中表達(dá)變化的報道。本研究采用尾狀核注入自體血的方法建立大鼠腦出血模型，分析Mip1基因在腦出血后腦組織中的表達(dá)及其與腦含水量（BWC）的關(guān)系，探討Mip1在腦出血損傷機(jī)制中的可能作用。

1材料與方法

1.1材料（1）實驗動物。10～12周齡清潔級雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量250～300 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供，自由進(jìn)食和飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組（n= 15）和ICH組（n=75），ICH組再根據(jù)造模后腦出血時間分為ICH 6 h、12 h、1 d、3 d和7 d組，每組15只。（2）主要試劑與儀器。立體定向儀（美國KOP-UMP2型），微型顱鉆（日本NSKNE 22L型），微量注射器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠），電子天平（日本AND HR120），恒溫干燥箱（北京朝陽區(qū)來廣營醫(yī)療器械廠），Canon照相機(jī)（日本株式會社），Zeiss顯微鏡成像系統(tǒng)（德國蔡司Zeiss Primo start），SPOT-Ⅱ數(shù)碼成像軟件（美國UVP公司），MetaMorph圖像分析軟件（美國Universal Imaging Corp），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司），石蠟切片機(jī)（徠克公司SQ2125），DAB濃縮型試劑盒（上?；鶢栴D生物科技有限公司），鼠抗人Mip1多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，SCBT），羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2模型制備所有大鼠術(shù)前禁食、禁水，以100 g/L水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠）腹腔注射麻醉（300 mg/kg），頭部及股部備皮，消毒，切開右股部皮膚，切口長10～15 mm，分離肌肉、神經(jīng)，暴露股動脈。俯臥位固定于立體定位儀上，正中切開頭皮，以前囟中央為原點，于前囟后0.2 mm，中線向右旁開3.5 mm處用牙科鉆鉆一直徑為1 mm的小孔至顱骨下硬膜［9］。抽取不加抗凝劑的股動脈血液100 μL，用微量注射器沿鉆孔方向垂直進(jìn)針，深約5.5 mm，以3～10 μL/min緩慢均速推注到大鼠尾狀核內(nèi)，注射完后將針停留5 min，緩慢退針，骨蠟封閉骨孔、縫合頭皮。假手術(shù)組麻醉過程同ICH組，僅用微量注射針刺入右側(cè)尾狀核。造模后6 h參照Bederson法進(jìn)行神經(jīng)功能評分：0分，無神經(jīng)功能缺失體征；1分，提尾時損傷對側(cè)前肢屈曲；2分，前肢屈曲及對側(cè)抵抗力下降；3分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識障礙。將神經(jīng)功能評分1～3分的大鼠納入本研究。實驗過程中因手術(shù)失敗、造模后神經(jīng)功能評分未達(dá)到要求等排除的大鼠均嚴(yán)格按照操作要求補(bǔ)齊。

1.3腦組織標(biāo)本制備各組于造模后相應(yīng)時點（6 h、12 h、1 d、3 d和7 d）各取5只大鼠，100 g/L水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉（300 mg/kg），迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。快速滴入37℃生理鹽水200 mL，無血污后改為滴入4℃多聚甲醛磷酸鹽緩沖液400 mL。斷頭處死、取腦，以血腫為中心按冠狀位切取血腫周圍2 mm的腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中12～24 h，脫水、石蠟包埋、連續(xù)冠狀切片，厚度約3 μm，按照試劑盒說明書進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察血腫周圍腦組織變化情況。

1.4腦含水量測定各組于造模后相應(yīng)時點（6 h、12 h、1 d、3 d和7 d）各取5只大鼠，100 g/L水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉（300 mg/kg），斷頭處死，取出完整腦組織，去除嗅球及額極前部4 mm的腦組織，以右側(cè)大腦半球中部注射針眼處冠狀位切割腦組織，可見在尾狀核部位有腦血腫，濾紙擦去腦組織表面水分，取血腫側(cè)腦組織置天平內(nèi)稱取濕質(zhì)量，然后置100℃電烤箱24 h，再迅速測干質(zhì)量。計算腦含水量（%）= （m濕腦-m干腦）/m濕腦×100%。

1.5免疫組化法檢測Mip1表達(dá)各組于造模后相應(yīng)時點（6 h、12 h、1 d、3 d和7 d）各取5只大鼠，100 g/L水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉（300 mg/kg），經(jīng)心臟灌注37℃生理鹽水200 mL和4℃、4%多聚甲醛后斷頭處死取腦，置于10%福爾馬林中浸泡固定48 h，流水沖洗，75%、85%、95%、100%乙醇逐級脫水。透明、浸蠟、包埋、切片，厚約4～7μm。脫蠟、水化、抗原修復(fù)。甩去PBS，加非免疫、正常羊血清封閉非特異性抗原，濕盒孵育20℃30 min。PBS洗3次，加一抗（Mip1 1：100）。4℃過夜，室溫放置40 min，PBS洗3次。加HRP標(biāo)記二抗（鼠抗）40 min，PBS洗3 min×3次，DAB染色3～10 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸乙醇分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度。75%、85%、95%、100%乙醇各脫水3 min。二甲苯透明3 min×2次，中性樹膠封片。使用Zeiss顯微鏡、SPOT-Ⅱ數(shù)碼成像軟件采集圖像，MetaMorph圖像分析軟件對圖像進(jìn)行綜合形態(tài)測量分析，測量陽性染色區(qū)光密度（OD）值［10］。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用以SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分神經(jīng)功能評分1、2、3分的大鼠分別有5、28、38只，0和4分的大鼠分別有1只和3只，模型制備的成功率為94.7%。

2.2腦組織病理學(xué)檢查結(jié)果假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，ICH各組血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元胞體明顯變小，胞漿淡染，胞質(zhì)內(nèi)尼氏體明顯減少，細(xì)胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙，見圖1。

Fig. 1 Nissl stainingof rat brain of six groups（HE，×200）圖1　各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果（HE，×200）

2.3各組血腫側(cè)腦含水量的比較ICH 12 h、1 d和3 d組腦含水量較假手術(shù)組增高（均P＜0.05），ICH 6 h和7 d組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.4免疫組化法檢測Mip1表達(dá)結(jié)果ICH各組大鼠腦組織血腫周圍有大量胞質(zhì)或胞核呈棕色的Mip1陽性細(xì)胞分布，可見腦組織細(xì)胞間隙和血管周圍間隙增寬，細(xì)胞皺縮濃染，見圖2。ICH 6 h、12 h、1 d和3 d組OD值較假手術(shù)組明顯升高（均P＜0.05），ICH 7 d組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；ICH 12 h、1 d、3 d組OD值均高于ICH 6 h和7 d組，ICH 12 h、1 d、3 d組3組間、ICH 6 h和7 d組2組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Tab. 1 Comparison of BWC and optical density value （OD）of Mip1 between six groups表1　各組腦含水量及Mip1表達(dá)的比較（n=5，x ±s）

3　討論

本研究應(yīng)用立體定向技術(shù)，將大鼠自體股動脈血液注入大鼠尾狀核，制成腦出血模型，與其他模型相比，此模型更接近臨床高血壓腦出血，適合研究腦實質(zhì)出血的自然過程，生理、生化變化，病理形態(tài)學(xué)特點及進(jìn)行治療學(xué)觀察［11］。本研究中腦出血模型制備的成功率高達(dá)94.7%。

本研究結(jié)果顯示，腦出血6 h后腦含水量逐漸增高，在3 d時達(dá)高峰，7 d時大致恢復(fù)正常，這與國外報道一致［12］。腦出血后第1天腦水腫明顯，這可能與腦出血后一系列病理生理變化有關(guān)，腦出血后血腫壓迫周圍腦組織引起血液循環(huán)障礙、血腦屏障受損和血腫分解產(chǎn)物釋放多種活性物質(zhì)［13］。凝血酶可導(dǎo)致腦出血后繼發(fā)性腦損傷，引起神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡、血腦屏障破壞、腦水腫及神經(jīng)炎癥反應(yīng)等［14］。腦出血后血管超微結(jié)構(gòu)也嚴(yán)重受損［15］。本研究通過HE染色可見腦出血組血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元胞體明顯變小，胞漿淡染，胞質(zhì)內(nèi)尼氏體明顯減少，細(xì)胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙，提示大鼠腦出血后組織水腫，隨后變性壞死。有研究顯示，腦出血患者第1天CT檢查，即可在患者血腫周圍組織中可見到明顯的腦水腫，血腫越大絕對水腫體積也較大，但相對水腫則較小，這是由于較大的血腫中包含的凝血酶、補(bǔ)體、炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞等成分較多，通過劑量效應(yīng)使得血腫周圍水腫更為嚴(yán)重；由于血腫對周圍組織的影響主要發(fā)生在血腫表面，較大的血腫相對而言只有較小的接觸面，因而其相對水腫較小［16］。本研究結(jié)果顯示，腦出血12 h～3 d腦水腫較假手術(shù)組和腦出血6 h時均明顯加重。有研究認(rèn)為腦出血后血腫周邊的缺血是很微弱的，腦出血模型損傷部位、注入部位和損傷面積與不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀有關(guān)［11］。本研究注入的血液為100 μL，較常規(guī)80 μL多，血液注射過程溢漏也會導(dǎo)致血腫不穩(wěn)定，血腫周圍水腫加重，均可能導(dǎo)致腦出血后12 h～3 d腦水腫較6 h明顯加重。

Fig. 2 Expression of Mip1 in the brain of six groups（immunohistochemistry，×200）圖2　Mip1在大鼠腦組織中的表達(dá)（免疫組化，×200）

Mip1是一個具有多種生物學(xué)功能的核轉(zhuǎn)錄因子。有研究顯示大鼠短暫非損傷性3 min缺血再灌注12 h、24 h后，腦Mip1表達(dá)增高，這可能是腦缺血耐受保護(hù)機(jī)制的一部分［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后血腫周圍腦組織存在Mip1的表達(dá)，且與血腫周圍腦含水量的變化趨勢基本一致。由此推測，Mip1可能參與減輕腦出血后腦水腫，保護(hù)腦組織免受損傷，但Mip1是通過何種通路發(fā)生作用的尚有待研究；另外，Mip1是否還參與維持血腦屏障完整性、星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移、神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及血管再生等功能均有待進(jìn)一步研究證實。

（圖1見插頁）

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（2015-06-01收稿2015-12-13修回）

（本文編輯陳麗潔）

The brain edema and Mip1 expression of perihematoma after intracerebral hemorrhage in rat model

ZHOU Renlan1，XIE Peng2，WANG Zhen2，LIU Lin2
1 Department of Rehabilitation，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2 Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University Corresponding Author E-mail：katherine69@yeah.net

Objective To explore the protective effect of Mip1 on cerebral edema by observing the Mip1 expression of perihematoma in intracerebral hemorrhage（ICH）rat model. Methods Ninety male SD rats were randomly divided into sham-operated group（n = 15）and ICH group（n = 75）. ICH group was equally subdivided into 6 h，12 h，1 d，3 d，and 7 d groups according to cerebral hemorrhage time，15 in each group. Hematoma was formed by infusing autologous femoral artery blood into the right caudate nucleus. Rats were killed at the above time points，brain tissues around hematoma were taked. The pathological morphological changes in brain tissue around hematoma were observed using HE staining. The water content of brain（BWC）was measured with dry /wet weight method，and immunohistochemistry was used to analyze the average optical density value of Mip1 protein in perihematoma. Results Neuronal cell body of perihematoma was significantly decreased after ICH，the cytoplasm light staining，Nissl body reduced obviously in cytoplasm，and edema fissure appeared around cells，however，no obvious changes of nerve cells were detected in sham-operated group. Brain edema gradually increased at 6 h，and reached peak at 3 d（all P＜0.05），then up to normal at 7 d after intracerebral hemorrhage （P＞0.05）. A large amount of brown Mip1 positive cells were found to distribute in cytoplasm and nucleus of perihematoma after intracerebral hemorrhage. The Mip1 protein expression level was higher in 6 h after intracerebral hemorrhage than that in sham-operated group（all P＜0.05），and returned to normal level at 7 d（P＞0.05）. Conclusion The high expression of Mip1 after ICH is in line with the trend of the brain edema development，and shows that the activation of Mip1 may participate in the pathological process of hemorrhagic cerebral edema.

cerebral hemorrhage；brain edema；rats，Sprague-Dawley；water content of brain；Mip1

R743.3

A

10.11958/59007

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科（郵編400016），2神經(jīng)內(nèi)科

周仁蘭（1969），女，副教授，博士，主要從事腦血管疾病的研究

E-mail：katherine69@yeah.net