韓振義，梁積新，胡　驥，羅洪義，卿　晶，陳玉清，李　光，李洪玉,

(1.中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京　102413；2.原子高科股份有限公司，北京　102413)

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64Cu標記兩種奧曲肽類似物的比較

韓振義1，梁積新1，胡驥2，羅洪義1，卿晶2，陳玉清2，李光2，李洪玉1, 2

(1.中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京102413；2.原子高科股份有限公司，北京102413)

摘要：對奧曲肽類似物DOTA-TOC和DOTA-TATE進行64Cu標記，研究多肽用量與64Cu活度比值、pH、反應溫度、反應時間對標記率的影響，優(yōu)化標記條件；考察標記物在10%胎牛血清與生理鹽水中的體外穩(wěn)定性；評價標記物在正常小鼠體內(nèi)分布情況以及在U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的攝取情況。結果表明：64Cu-DOTA-TOC和64Cu-DOTA-TATE標記率均>95%；在生理鹽水中具有良好穩(wěn)定性，10%胎牛血清中發(fā)生緩慢分解；正常小鼠體內(nèi)分布實驗結果顯示，兩種標記物在血液中清除較快，主要通過腎、肝代謝，64Cu-DOTA-TATE攝取均高于64Cu-DOTA-TOC；64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE給藥后腫瘤PET顯像清晰，但64Cu-DOTA-TATE顯像效果優(yōu)于64Cu-DOTA-TOC。研究結果可為其醫(yī)學應用提供依據(jù)。

關鍵詞：奧曲肽類似物；64Cu 標記；生物分布；Micro PET顯像

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumors, NETs)可發(fā)生于整個神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，最常見于胃、腸和胰腺等部位。美國研究顯示，神經(jīng)內(nèi)分泌瘤發(fā)病率為0.125‰，近年來，檢出率呈不斷增長趨勢。生長抑素(somatostatin, SMS)及類似物對生長抑素受體(somatostatin receptor, SSTR)親和力強，能在體內(nèi)特異性結合。SSTR有SSTR1～SSTR5五種亞型，SSTR2在類癌瘤、腦垂體腺瘤、嗜鉻細胞瘤、甲狀腺髓樣癌、腦膜瘤等神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中過度表達[1]。目前，臨床上廣泛應用的SMS及其類似物主要有奧曲肽(Octreotide, OC)、蘭瑞肽(Lanreotide)和維瑞肽(Vapreotide, RC-160)[2]。對SMS進行放射性同位素標記得到放射性多肽藥物，能與腫瘤上的 SSTR 特異結合，達到臨床功能顯像和受體導向治療的目的[3]。奧曲肽類似物Tyr3-Octreotide (TOC)與Tyr3-Octreotate(TATE)對SSTR2親和力高，但TATE親和性為TOC的10倍[4-5]。多種醫(yī)用放射性核素，如68Ga、90Y、111In、177Lu等通過雙功能螯合劑DOTA(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸)標記TOC 與TATE，已廣泛用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷和治療[6-7]。

近年來，隨著全球范圍內(nèi)正電子發(fā)射斷層掃描技術(PET)的迅速發(fā)展，64Cu放射性藥物的研究受到越來越多的關注，其主要用于血池與心肌、乏氧、炎癥、腫瘤的顯像及治療[8]。64Cu為新型醫(yī)用正電子核素，半衰期為12.7 h，通過電子俘獲(41%)、β-(0.573 MeV，40%)和β+(0.656 MeV，19%)方式衰變。由于64Cu半衰期較長，可用于標記靶向性好但體內(nèi)代謝時間較長的多肽藥物，64Cu標記多肽藥物是目前重要研究方向。Hanaoka等[9]研究64Cu-DOTA-TOC在人源神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG模型動物中的生物行為，發(fā)現(xiàn)64Cu-DOTA-TOC在腫瘤中濃集高且滯留時間長，腫瘤Micro PET顯像清晰；Malmberg 等[10]將64Cu-DOTA-TATE用于動脈粥樣硬化斑塊的臨床研究。國內(nèi)已經(jīng)成功采用C-30質(zhì)子回旋加速器制備高比活度醫(yī)用64Cu，實現(xiàn)了64Cu的商品化供應[11]。64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE均是具有臨床應用前景的奧曲肽類藥物，尚未有研究比較這兩種藥物在神經(jīng)內(nèi)分泌瘤方面的應用。本研究對DOTA-TOC 和DOTA-TATE進行64Cu標記，比較這兩種多肽類藥物在正常小鼠體內(nèi)的行為以及在U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的攝取情況，探討其作為神經(jīng)內(nèi)分泌瘤PET顯像劑的應用價值，為臨床醫(yī)學應用及產(chǎn)品提供依據(jù)。

1實驗材料

1.1主要儀器

Sartorius BS100S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；CRC-15R放射性活度計：Capintec公司；高效液相(HPLC)色譜系統(tǒng)：Prostar320，美國Varian公司；C18色譜柱：Hypersil ODSΦ 4.6 mm×250 mm，大連依利特公司；C18 Sep-Pak柱：Waters公司；GABI型高效液相色譜放射性監(jiān)控儀： Raytest公司；1470自動伽瑪計數(shù)器：Perkin Elmer公司；小型正電子發(fā)射斷層掃描儀(Micro PET)：Eplus-166，中國科學院高能物理研究所研制；超純水系統(tǒng)：Milli-Q Advantage A10，Merck公司。

1.2主要試劑

DOTA-TOC：純度>95%，杭州中肽生化有限公司；DOTA-TATE：純度>99%，Biomedizinische Forschungsreagenzien GmbH公司；64CuCl2溶液：64Cu放射性核純度>99%，生產(chǎn)批號分別為20110615、20120613、20130508與20140623，原子高科股份有限公司提供；龍膽酸、乙酸鈉、無水乙醇等：分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司；乙腈：色譜純，Burdick&Jackson公司；實驗用水均為Milli-Q水。

1.3實驗動物

昆明小白鼠：32只，雌性，體重20～25 g，清潔級，中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠：4只，雌性，SPF級，腫瘤直徑約10～15 mm，中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供。

2實驗方法

2.164Cu標記物的制備

100 μL龍膽酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.5)中依次加入20～30 μL 1 g/L的DOTA-TOC (或 DOTA-TATE)溶液，5～10 μL64CuCl2溶液(約74～370 MBq，溶于0.1 mol/L HCl中)，充分混合，在50 ℃下反應10～30 min。為優(yōu)化標記條件，選用多肽(μg)與64Cu放射性活度(mCi)比值分別為2.5、5.0、 7.5、12.5，考察多肽用量與64Cu放射性活度比值對標記率的影響。將5 μL64Cu(約1 mCi)加入到30 μL DOTA-TOC(或DOTA-TATE)中，再分別加入100 μL龍膽酸醋酸鈉緩沖液(pH分別為3.6、4.0、4.6、5.0、5.5)，分別混合均勻后在50 ℃下反應30 min后，進行HPLC分析，考察pH對標記率的影響。分別考察反應溫度、反應時間對64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE標記率的影響，優(yōu)化標記條件。

2.264Cu標記物的純化

將反應液加載到經(jīng)乙醇和0.1% HCl預先活化后的C18 Sep-Pak柱上，用10 mL 0.1% HCl溶液將游離64Cu洗出，再用3～5 mL 95%乙醇將64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)解吸并收集。收集組分用溫和N2氣流緩慢吹干，用適量體積的生理鹽水溶解，備用。

2.3質(zhì)量控制

采用高效液相色譜(HPLC)法對兩種64Cu標記物進行質(zhì)控分析。C18反相色譜柱，流動相A：0.1% TFA/H2O；流動相B：0.1% TFA/乙腈。洗脫梯度：0～2 min，5%B；2～10 min，5%～80%B；10～15 min，80%B；15～20 min，80%～5%B。流速：1.0 mL/min。紫外檢測器波長為220 nm。

2.4體外穩(wěn)定性

取2.2節(jié)所得0.1 mL64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)溶液(約111 MBq)加入至0.9 mL 10%胎牛血清中，混勻， 37 ℃下溫育，分別于0、0.5、1、2、3 h后取0.1 mL混合液加入離心管中，再加0.1 mL乙醇溶液渦旋混勻，離心，取上清液，測定放化純度，并與室溫時標記物在生理鹽水中的穩(wěn)定性進行比較。

2.5正常小鼠體內(nèi)生物分布

雌性昆明小白鼠32只，隨機分組，每組4只。經(jīng)尾靜脈注射純化后的0.1 mL64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)溶液(370～555 kBq)，注射0.5、1、2、3 h后斷頭處死，取血、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、胰腺等臟器，稱重并測量其放射性計數(shù)，計算每克臟器的放射性攝取占總注射劑量的百分數(shù)(%ID·g-1)。

2.6Micro PET顯像

荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠4只，隨機分成2組，每組2只。經(jīng)尾靜脈注射純化后的0.1 mL64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)溶液(約18.5 MBq)，采用混合氣體麻醉法對裸鼠麻醉。于給藥后1、6 h進行Micro PET顯像，每只采集時間為15 min。

3結果與討論

3.164Cu標記物制備與質(zhì)量控制

3.1.1制備條件的優(yōu)化多肽用量與64Cu放射性活度比值、pH、反應溫度、反應時間對標記率的影響分別示于圖1～圖4。

圖1　多肽用量與64Cu活度比值對標記率的影響Fig.1　Influence of ratio(peptides mass/64Cu activity)

圖2　pH值對標記率的影響Fig.2　Influence of pHon radiolabeling yeild

圖3　反應溫度對標記率的影響Fig.3　Influence of temperatureon radiolabeling yield

由圖1～圖4可知，優(yōu)化后多肽64Cu標記條件：DOTA-TOC(或DOTA-TATE)用量與64Cu放射性活度比值大于12.5，pH為3.6～5.5之間，反應溫度在30～50 ℃之間，反應時間大于10 min。

按優(yōu)化條件對DOTA-TOC與DOTA-TATE進行64Cu標記，得到目標產(chǎn)物64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE，標記率均>95%。經(jīng)Sep-Pak柱純化后，兩種64Cu標記多肽藥物的放化純度均>98%。

3.1.2質(zhì)量控制經(jīng)C18 Sep-Pak柱純化后的64Cu-DOTA-TOC、64Cu-DOTA-TATE Radio-HPLC圖譜示于圖5。由圖5可知，64Cu-DOTA-TOC的保留時間為12.6 min，游離64CuCl2的保留時間為4.5 min，其放化純度>95%。64Cu-DOTA-TATE的保留時間為14.5 min，其放化純度>95%。

圖4　反應時間對標記率的影響Fig.4　Influence of time on radiolabeling yield

圖5　64Cu-DOTA-TOC和64Cu-DOTA-TATE的Radio-HPLC圖譜Fig.5　Radio-HPLC spectrum of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE

3.2體外穩(wěn)定性

64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE在10%胎牛血清與生理鹽水中的體外穩(wěn)定性分別示于圖6、圖7。從圖中可以看出，64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE在10%胎牛血清中發(fā)生緩慢分解，但37 ℃下溫育2 h后放化純度仍大于90%。室溫下在生理鹽水中溫育3 h后，放化純度大于95%，未見明顯分解，表明其在生理鹽水中穩(wěn)定性好。

3.3正常小鼠體內(nèi)的生物學分布

64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE在正常小鼠體內(nèi)的生物分布數(shù)據(jù)列于表1。

由表1可知，64Cu-DOTA-TOC在血液中放射性攝取少且清除快；腎臟放射性攝取高，給藥30 min后達到(10.55±1.71) %ID·g-1，滯留時間長，3 h 后仍為(4.31±0.90) %ID·g-1，提示標記物在小鼠體內(nèi)主要通過腎代謝；在肝臟攝取高且滯留時間長，給藥30 min與3 h后分別為(6.29±0.64) %ID·g-1與(4.99±0.78) %ID·g-1；胰腺中放射性攝取高且滯留時間長，提示胰腺中生長抑素受體的存在。64Cu-DOTA-TOC在生物體內(nèi)穩(wěn)定性較差，可能部分發(fā)生分解產(chǎn)生游離64Cu，從而表現(xiàn)為肝、胃、小腸攝取高。

圖6　64Cu-DOTA-TOC在10%胎牛血清與生理鹽水中的穩(wěn)定性Fig.6　In vitro stability of64Cu-DOTA-TOCin 10% bovine serum and 0.9% saline

圖7　64Cu-DOTA-TATE在10%胎牛血清與生理鹽水中的穩(wěn)定性Fig.7　In vitro stability of64Cu-DOTA-TATEin 10% bovine serum and 0.9% saline

64Cu-DOTA-TATE在血液中濃集少，但攝取高于64Cu-DOTA-TOC(給藥后1、2、3 h，P<0.05，二者均有顯著性差異)；在肝中攝取高于64Cu-DOTA-TOC；腎中攝取高且代謝緩慢，在30 min時攝取低于64Cu-DOTA-TOC，隨后，攝取均高于64Cu-DOTA-TOC，可知，64Cu-DOTA-TOC在腎中代謝速度快于64Cu-DOTA-TATE；胰腺中攝取低于64Cu-DOTA-TOC。

3.4Micro PET顯像

荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠在給藥1、6 h后的Micro PET顯像示于圖8。

Table 1Invivobiodistribution of64Cu-DOTA-TOC and

組織不同時間各組織放射性攝取率/(%ID·g-1)30min1h2h3hTOCTATETOCTATETOCTATETOCTATE血1.96±0.522.09±0.310.73±0.181.38±0.161)0.61±0.081.24±0.291)0.49±0.051.13±0.281)心1.59±0.382.13±0.351)0.90±0.202.04±0.121.39±0.202.51±0.391)1.05±0.132.34±0.311)肝6.29±0.648.34±1.091)4.15±0.847.65±0.941)5.11±0.516.41±0.354.99±0.786.02±0.071)脾0.92±0.211.54±0.100.64±0.191.88±0.251.25±0.152.95±0.971)1.23±0.163.05±0.711)肺3.99±0.923.75±0.173.19±0.583.54±0.441)3.78±0.914.56±0.583.21±0.544.08±0.221)腎10.55±1.719.72±1.025.91±0.868.57±0.525.83±0.787.03±0.484.31±0.906.44±0.901)胃4.43±0.434.31±0.293.86±0.935.71±0.794.22±0.726.76±0.831)4.44±0.565.08±0.781)小腸3.25±0.633.50±0.511)2.35±1.256.18±1.921)3.28±0.554.82±0.561)2.73±0.503.60±0.231)肌肉0.63±0.210.76±0.080.30±0.120.74±0.430.29±0.060.61±0.050.22±0.050.67±0.09胰腺4.14±0.722.35±0.191)3.30±0.402.46±0.091)3.65±0.512.48±0.151)2.63±0.792.37±0.461)

注：1)64Cu-DOTA-TATE與64Cu-DOTA-TOC相比，放射性攝取有顯著性差異，P<0.05

a——TOC給藥后1 h；b——TOC給藥后6 h；c——TATE給藥后1 h；d——TATE給藥后6 h圖8　64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE在荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的Micro PET顯像a——at 1 h postinjection of TOC;b——at 6 h postinjection of TOC;c——at 1 h postinjection of TATE;d——at 6 h postinjection of TATEFig.8　Micro PET images of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATEin U87MG tumor-bearing nude mice

從圖8可知，64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE給藥1 h后腫瘤均顯像清晰；給藥6 h后，64Cu-DOTA-TATE腫瘤顯像效果優(yōu)于64Cu-DOTA-TOC，可能原因為U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中SSTR2高表達，DOTA-TATE對SSTR2的親和力高于DOTA-TOC。

64Cu-DOTA-TATE在U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中放射性濃集更高，PET顯像效果更佳，作為此類腫瘤的陽性PET顯像劑具有一定優(yōu)勢。

4小結

64Cu-DOTA-TOC與64Cu-DOTA-TATE在生理鹽水中具有良好的穩(wěn)定性， 10%胎牛血清中長時間溫育后，發(fā)生緩慢分解。在正常小鼠體內(nèi)均表現(xiàn)為血清除快；肝、腎放射性攝取高，體內(nèi)代謝途徑主要為腎與肝，但64Cu-DOTA-TATE分布高于64Cu-DOTA-TOC；胰腺中有明顯放射性攝取，提示胰腺中生長抑素受體的存在。腫瘤PET顯像均清晰可見，但64Cu-DOTA-TATE效果優(yōu)于64Cu-DOTA-TOC。實驗結果表明，64Cu-DOTA-TOC和64Cu-DOTA-TATE可用于生長抑素受體陽性腫瘤PET顯像，研究結果為醫(yī)學應用及產(chǎn)品市場化提供依據(jù)。

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Comparison of Two Kinds of64Cu Labelled Octreotide Analogues

HAN Zhen-yi1, LIANG Ji-xin1, HU Ji2, LUO Hong-yi1, QING Jing2,CHEN Yu-qing2, LI Guang2, LI Hong-yu1,2

(1.DepartmentofIsotope,ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China;2.HTACo.,LTD,Beijing102413,China)

Abstract:Octreotide analogues DOTA-TOC and DOTA-TATE were labeled with64Cu. The influences of the ratio of peptide mass to64Cu activity, pH value, temperature and reaction time on labeling yield were investigated. The optimum labeling was determined.Invitrostability tests in saline and 10% bovine serum had been carried out. Biodistribution of the two radiolabelled compounds in normal mice and Micro PET imaging in nude mice bearing U87MG tumor had been evaluated. The results showed that the labeling yields of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE were higher than 95%. Two kinds of octreotide analogues labeled with64Cu were quite stable in saline and decomposed slowly in 10% bovine serum at 37 ℃. Biodistribution results in normal mice showed that two64Cu labelled tracers had similar profiles. Both of the compounds washed out from the blood quickly. High uptake of radioactivity in liver and kidneys indicated the tracers were excretedviaboth hepatobiliary system and renal system. At the same time, compared to64Cu-DOTA-TOC, higher radioactivity accumulation of64Cu-DOTA-TATE in liver and kidneys was observed. Micro PET images of U87MG tumor-bearing nude mice with64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE showed the tumors very clearly. The radioactivity uptake of64Cu-DOTA-TATE in tumor was higher than that of64Cu-DOTA-TOC. This work has paved the way for further preclinical and clinical application of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE as PET tumor imaging agents.

Key words：octreotide analogues;64Cu-labeling; biodistribution; Micro PET imaging

收稿日期：2016-01-14;修回日期：2016-03-14

基金項目：國際原子能機構 CRP資助項目(Contract No.15899)

作者簡介：韓振義(1985—)，男，山東人，執(zhí)業(yè)藥師，分析化學專業(yè) 通信作者：梁積新，研究員，E-mail: liangjixin99@yahoo.com

中圖分類號：TL92+3

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)02-0082-07

doi：10.7538/tws.2016.29.02.0082