裴繼誠，殷允北，胡　穩(wěn)，卜　鑫，申正會，張方東

(天津科技大學(xué) 造紙學(xué)院，天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300457)

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漆酶-TEMPO體系選擇性氧化殼聚糖C-6伯羥基提高其抗氧化性能的研究*

裴繼誠，殷允北，胡穩(wěn)，卜鑫，申正會，張方東

(天津科技大學(xué) 造紙學(xué)院，天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300457)

摘要：利用漆酶-TEMPO體系選擇性地氧化殼聚糖C-6伯羥基，對氧化產(chǎn)物分別進(jìn)行紅外光譜、13C NMR、離子色譜和熱失重分析，確定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化，并進(jìn)一步對其抗氧化性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，經(jīng)漆酶-TEMPO體系氧化后，殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的C-6伯羥基被選擇性地氧化成羧基，其它結(jié)構(gòu)基本不變，其產(chǎn)物為氧化殼聚糖鈉鹽；殼聚糖氧化產(chǎn)物與原樣相比，熱穩(wěn)定性得到了提高；殼聚糖經(jīng)漆酶-TEMPO體系氧化后的ABTS自由基清除率5 min后達(dá)到66.36%，抗氧化性能得到改善。

關(guān)鍵詞：漆酶；TEMPO；殼聚糖；抗氧化性

0引言

殼聚糖(chitosan，CS)是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖，自1859年，法國人Rouget首先得到殼聚糖后，這種天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥、食品、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫(yī)學(xué)工程等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用研究取得了重大進(jìn)展[1-4]。一些研究表明殼聚糖在體外具有一定的抗氧化性能[5-6]，作為食品添加劑時，殼聚糖通過與金屬離子的螯合[7-8]從而防止脂質(zhì)氧化，是一種次要型抗氧化劑(secondary antioxidant)。而主要型抗氧化劑(primary anti- oxidant)為自由基提供電子或者氫質(zhì)子使自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的中間體，防止它們進(jìn)一步發(fā)生自由基反應(yīng)，從而有效地抑制氧化反應(yīng)[9]。雖然殼聚糖的N原子有一對非共用電子對，可以潛在地提供電子，但是由于殼聚糖酸化后在溶液中的pKa約為6.3，氨基大多被質(zhì)子化無法提供電子，從而導(dǎo)致其抗氧化性較差，限制了其在許多領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，對殼聚糖改性改善其抗氧化性成為近年來研究的熱點(diǎn)。殼聚糖中含有的C-6伯羥基和C-2氨基反應(yīng)活性較高，殼聚糖的改性方式主要在C-2氨基上通過?；?、烷基化、季銨鹽化、接枝共聚、Schiff堿反應(yīng)、交聯(lián)等消耗一定量的化學(xué)試劑與殼聚糖結(jié)合的方式引入新的基團(tuán)[10]，針對殼聚糖C-6伯羥基改性的方法主要有羧基化、烷基化、氧化。根據(jù)定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)，物質(zhì)所在溶液pH值與物質(zhì)的抗氧化性能正相關(guān)，溶液的pH值越高，越有利于物質(zhì)易被氧化基團(tuán)的去質(zhì)子化，物質(zhì)易被氧化基團(tuán)的供電子能力得到提高，從而提高物質(zhì)的抗氧化性能[11]。因此在不改變殼聚糖C-2氨基的基礎(chǔ)上將其C-6伯羥基氧化成羧基并轉(zhuǎn)變成羧酸鹽形式，改性后的殼聚糖在溶液中通過羧酸根的電離提高溶液的pH值，從而抑制殼聚糖C-2氨基的質(zhì)子化，提高氨基的供電子能力，改善產(chǎn)物的抗氧化性能。

2，2，6，6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)是一種具有穩(wěn)定氮氧自由基結(jié)構(gòu)的環(huán)狀化合物。De Nooy 等[12]在1995年首次發(fā)現(xiàn)TEMPO自由基形式經(jīng)催化劑氧化后轉(zhuǎn)變成 TEMPO+亞硝基形式可以選擇性地將醇氧化成醛基或羧基，并利用NaBr-NaClO將TEMPO自由基形式氧化成TEMPO+亞硝基形式并選擇性地將水溶性多聚糖如馬鈴薯淀粉、淀粉糊精和支鏈淀粉中吡喃糖基的C-6 伯羥基選擇性氧化成醛基或羧基。后來Izumi shibata和Akira Isogai[13]利用13C NMR推測了TEMPO- NaBr-NaClO體系氧化纖維素的機(jī)理，即在NaBr和NaClO的作用下，TEMPO被氧化成TEMPO+，TEMPO+再選擇性將伯羥基氧化成羧基，TEMPO+轉(zhuǎn)變?yōu)門EMPOH，NaBr-NaClO再將TEMPOH氧化成TEMPO從而進(jìn)行下一步反應(yīng)。

Fabbrini等[14]在2001年發(fā)現(xiàn)了漆酶可以將TEMPO自由基形式氧化成TEMPO+亞硝基形式，并可將TEMPOH 羥胺形式氧化成TEMPO自由基形式。后來，Elisabetta Aracri等[15]證明了漆酶-TEMPO體系可以選擇性地將劍麻纖維素C-6伯羥基氧化成羧基。Arends等[16]將漆酶與TEMPO組合用于催化分子氧對醇的氧化，反應(yīng)在室溫、常壓和pH值為5的條件下進(jìn)行。文獻(xiàn)[17-18]已經(jīng)證實(shí)TEMPO-NaBr-NaClO 體系可以將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基，因此從理論上漆酶-TEMPO體系也可以將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基。漆酶是一種環(huán)保型酵素，催化苯酚類、芳香胺和其它富含電子的底物單電子氧化,同時將氧分子還原成水[19]。

本文從環(huán)保的角度出發(fā)，采用漆酶-TEMPO體系選擇性將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基，生成殼聚糖羧酸鹽，借助羧酸根在溶液中的電離抑制殼聚糖C-2氨基的質(zhì)子化，提高氨基給電子能力，改善殼聚糖的抗氧化能力，擴(kuò)寬殼聚糖應(yīng)用領(lǐng)域。

1實(shí)驗材料與方法

1.1材料與設(shè)備

漆酶：由諾維信公司提供，商品號NOVOZYME 51003，酶活1072 U/mL；殼聚糖：實(shí)驗室自制，分子量2 729 Da，脫乙酰度≥97%；2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)：購于Sigma-Aldrich公司。

傅立葉紅外光譜儀(FT-IR)：型號VERTEX 70，德國布魯克公司；核磁共振譜儀(NMR)：型號AVANCE III，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司；離子色譜儀(HPIC)：型號ICS1100，美國戴安公司；熱重分析儀(TGA)：型號Q500-V20.6，美國TA儀器公司；紫外分光光度計(UV)：型號UV-2550，日本島津公司。

1.2殼聚糖氧化方法

2 g殼聚糖和4% TEMPO溶于200 mL pH值=4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，添加200 μL漆酶，30 ℃水浴鍋中通氧反應(yīng)18 h[15]。反應(yīng)后濾去不溶物，調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液后加入適量無水乙醇析出產(chǎn)物，微孔濾膜 (0.45 μm) 過濾。過濾所得固體溶于去離子水中，微孔濾膜 (0.45 μm) 過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液后加入適量無水乙醇析出產(chǎn)物，重復(fù)2次，所得固體常溫真空干燥，樣品密封保存。不添加漆酶和TEMPO處理的樣品表示為CS-control；只經(jīng)漆酶處理的樣品表示為CS-Laccase；經(jīng)漆酶-TEMPO體系氧化產(chǎn)物表示為CS-Laccase-TEMPO。

1.3檢測方法

1.3.1FT-IR檢測

取1 mg樣品和100 mg干燥的KBr，一起研磨5 min 后壓片，然后用FT-IR測定，掃描范圍為4 000～650 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描16次，以空氣作為采樣背景。

1.3.213C NMR檢測

13C NMR采用瑞士布魯克拜厄斯賓400M超導(dǎo)核磁共振儀進(jìn)行測定。稱取100 mg樣品溶于0.6 mL的D2O中，采樣條件為采用30°脈沖序列，采樣時間1.36 s，弛豫時間1.89 s，累積掃描30 000次。

1.3.3離子色譜檢測Na+含量

通過離子色譜儀檢測Na+含量表征羧基含量。樣品中的Na+來自羧基攜帶的Na+和樣品純化過程中殘留在樣品中的Na+。根據(jù)式(1)可計算出羧基含量

羧基含量=(T-T0)/23

(1)

T為經(jīng)漆酶/TEMPO/O2處理樣品鈉離子含量，mg/L；T0為空白樣鈉離子含量，mg/L；23為鈉元素相對分子質(zhì)量。

離子色譜測試條件：色譜柱，IonPac CS16；淋洗液，30 mmol/L甲烷磺酸；柱溫，40 ℃；池溫，45 ℃；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣體積，25 μL；抑制器，CSRS (陽離子連續(xù)自動再生電解抑制器)；電流，88 mA；檢測器，電導(dǎo)檢測器。

配置濃度分別為30，45，75，90，150 mg/L的Na+溶液標(biāo)樣，使用離子色譜儀檢測標(biāo)樣Na+色譜圖，記錄各濃度對應(yīng)的峰面積。以Na+濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示。

圖1　Na+含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

配置1 g/L的樣品溶液，使用離子色譜儀檢測Na+色譜圖，記錄峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Na+含量。

其中，r=0.9999，曲線回歸方程為

y=0.2751x。

1.3.4TGA檢測

使用Q500-V20.6熱重分析儀對樣品進(jìn)行TGA分析，每個樣品重2～5 mg，以氮?dú)庾鳛檩d體，流速為50 mL/min，實(shí)驗溫度從室溫升至600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，得到熱失重曲線。

1.3.5抗氧化性能檢測[20]

配制濃度為2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液與濃度為7.4 mmol/L的ABTS溶液，分別量取2 mL混合，在避光處儲存12 h，制得ABTS自由基溶液，然后用無水乙醇稀釋50～60倍至734 nm處吸光度為0.700±0.025。取2 mg試樣溶于2 mL去離子水中，再與8 mL稀釋后的自由基溶液發(fā)生反應(yīng)，共進(jìn)行40 min。反應(yīng)每進(jìn)行5 min對溶液在734 nm處的吸光度進(jìn)行測定。另取2 mL去離子水與8 mL稀釋后的自由基溶液混合，作為空白樣。

利用式(2) 計算其自由基消除率，消除率越高，抗氧化性能越強(qiáng)。

(2)

A0為空白樣吸光度；A1為反應(yīng)后吸光度。

2實(shí)驗結(jié)果與討論

2.1紅外光譜分析

通過紅外光譜分析殼聚糖氧化前后官能團(tuán)的變化，CS-control和CS-Laccase-TEMPO的紅外吸收光譜如圖2所示。

圖2CS-control和CS-Laccase-TEMPO的FT-IR圖

Fig 2 FT-IR spectra of CS-control and CS-Laccase-TEMPO

對比CS-control的紅外光譜，CS-Laccase-TEMPO的紅外光譜中的特征吸收峰與CS-control的極其相似，特別是1 610 cm-1對應(yīng)酰胺Ⅱ(—NH2)譜帶的吸收峰強(qiáng)度基本不變，表明了殼聚糖C-2氨基未被氧化。

2.213C NMR分析

通過13C NMR探究物質(zhì)碳元素種類的變化及漆酶-TEMPO體系氧化殼聚糖機(jī)理。圖3為CS-control，CS-Laccase和CS-Laccase-TEMPO的13C NMR譜圖。

圖3CS-control、CS-Laccase和CS-Laccase-TEMPO的13C NMR譜圖

Fig 313C NMR spectra of CS-control，CS-Laccase and CS-Laccase-TEMPO

從圖3可看出，CS-control、CS-Laccase和CS-Laccase-TEMPO的13C NMR譜圖相比，只有CS-Laccase-TEMPO在δC=179處出現(xiàn)了新的共振峰，由文獻(xiàn)[25- 27]可知該共振峰為—COO-的共振峰，其它信號源基本一致，由此可表明漆酶- TEMPO體系選擇性將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基，其它結(jié)構(gòu)基本不變；CS-Laccase 的13C NMR譜圖與CS-control相比無明顯變化，表明了漆酶和TEMPO的協(xié)同作用才能將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基。圖3中，δC=58.7，60.3，79.1，77，74和101處的信號分別源于氨基葡糖糖環(huán)的C-2，C-6，C-4, C-5, C-3和C-1共振峰，此結(jié)果與已有文獻(xiàn)一致[27- 28]。CS-Laccase-TEMPO在δC=60.32處的氨基葡糖糖環(huán)的C-6伯羥基共振峰依舊存在，表明仍有氨基葡糖糖環(huán)上的C-6伯羥基未被氧化。

2.3離子色譜(HPIC)分析

純化后的產(chǎn)物中所含的Na+來自反應(yīng)體系及反應(yīng)產(chǎn)物的羧基攜帶的Na+。若樣品CS-Laccase-TEMPO中Na+含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于樣品CS-control和CS-Laccase的Na+含量，可表明樣品CS-Laccase-TEMPO中含有大量的羧基從而攜帶了大量的Na+，繼而表明漆酶-TEMPO體系將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基。經(jīng)離子色譜儀檢測樣品CS-control，CS-Laccase和CS-Laccase-TEMPO的Na+含量如圖4所示。

圖4CS-control，CS-Laccase和CS-Laccase-TEMPO的Na+含量

Fig 4 The Na+content of CS-control，CS-Laccase and CS-Laccase-TEMPO

由圖4可以看出，樣品CS-Laccase-TEMPO中Na+含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于樣品CS-control和CS-Laccase的Na+含量,表明了漆酶-TEMPO體系將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基；樣品CS-control和CS-Laccase的Na+含量基本一致，表明了漆酶和TEMPO的協(xié)同作用才能將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基。由式(1)可得出羧基含量為4.13 mmol/g。Na+含量分析結(jié)果驗證了13C NMR的分析結(jié)果。

結(jié)合國內(nèi)外研究成果及以上檢測結(jié)果推測了漆酶-TEMPO體系選擇性氧化殼聚糖C-6伯羥基的反應(yīng)機(jī)理(圖5)，即漆酶-TEMPO體系選擇性地將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基的反應(yīng)分為4個階段:(1)Laccase與TEMPO自由基形式反應(yīng)生成Laccaseox和TEMPO+亞硝基形式；(2)TEMPO+將殼聚糖上的C-6伯羥基氧化成羧基，而其被還原成TEMPOH羥胺形式。C-6羧基在 Na+存在下，轉(zhuǎn)化為其鈉鹽狀態(tài)；(3)TEMPOH與Laccase反應(yīng)重新生成TEMPO自由基；(4)Laccaseox與O2反應(yīng)生成水和Laccase，從而進(jìn)而進(jìn)行下一輪反應(yīng)。

圖5　漆酶-TEMPO體系氧化殼聚糖的推測機(jī)理圖

Fig 5 A possible reaction mechanism for the laccase-TEMPO system oxidation of chitosan

2.4TGA分析

通過 TGA檢測物質(zhì)熱穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性越高，分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。CS-Laccase-TEMPO和CS-control的TGA曲線如圖6所示。

圖6　CS-Laccase-TEMPO和CS-control的TGA曲線

Fig 6 TGA curve of CS-Laccase-TEMPO and CS-control

從圖6可以看出，樣品的熱降解和熱氧解可分為3個階段。

第一階段在140 ℃附近，伴隨著吸熱反應(yīng)，兩者在140 ℃前均有一個小的失重過程，這是由于多糖具有比較強(qiáng)的水親和力和水化特性[29]，樣品中的結(jié)合水和結(jié)晶水熱蒸發(fā)導(dǎo)致失重。CS-control和CS-Laccase-TEMPO相比，失重速率更快，質(zhì)量下降更多。

第二階段在160～400 ℃，為殼聚糖的主要降解階段，主要發(fā)生主鏈的脫乙酰和糖苷鍵的斷裂反應(yīng)[30]。在這過程中，CS-Laccase-TEMPO和CS-control失重分別約為40.01%和52.71 %。

第三階段在400～600 ℃，主要發(fā)生吡喃環(huán)的裂解以及碳化殘渣的分解[31-33]，分解速度較為緩慢，600 ℃時，CS-Laccase-TEMPO和CS-control失重分別約為56.49%和73.39%。

2.5抗氧化性能分析

實(shí)驗通過檢測物質(zhì)的ABTS自由基清除率來評定物質(zhì)的總抗氧化性能。在此反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)氧化后生成相對穩(wěn)定的藍(lán)綠色的ABTS·+溶液，且在734 nm處具有典型的特征吸收峰。抗氧化劑與ABTS·+反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光度值下降，下降越大表明物質(zhì)的總抗氧化性能越強(qiáng)。 圖7顯示的是CS-Laccase-TEMPO和CS-control的ABTS自由基清除率。

圖7CS-Laccase-TEMPO和CS-control的ABTS自由基清除率

Fig 7 ABTS·+radical scavenging ability of CS-Laccase-TEMPO and CS-control

由圖7可知，靜置5 min后，CS-Laccase-TEMPO的自由基清除率已達(dá)到66.36%，具有較強(qiáng)的抗氧化性；CS-control的自由基清除率達(dá)到44.22%，具有較弱的抗氧化性。隨著時間的增加，二者都緩慢增加，40 min時CS-Laccase-TEMPO的自由基清除率已達(dá)到92.37%，ABTS自由基溶液接近無色；CS-control的自由基清除率達(dá)到62.65%，2 h后，CS-control的ABTS自由基溶液接近無色。

3結(jié)論

漆酶-TEMPO體系可以選擇性地將殼聚糖分子中的C-6伯羥基氧化成羧基，其產(chǎn)物為氧化殼聚糖鈉鹽；產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性提高，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)；產(chǎn)物對ABTS自由基清除率達(dá)到66.36%，抗氧化能力得到改善，具有較強(qiáng)的抗氧化性。由于經(jīng)漆酶-TEMPO體系氧化的殼聚糖較強(qiáng)的抗氧化性可以防止脂質(zhì)被氧化，因此氧化后的殼聚糖在食品包裝材料和食品添加劑方面具有很好的潛在應(yīng)用價值。

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Study on the selective oxidation of the C-6-hydroxyl of chitosan b laccase-TEMPO system to improve antioxidant capability of the product

PEI Jicheng, YIN Yunbei, HU Wen, BU Xin, SHEN Zhenghui, ZHANG Fangdong

(Tianjin Key Laboratory of Pulp & Paper, Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457, China)

Abstract:Research adopting laccase-TEMPO system to selectively oxidise the C-6-hydroxyl of chitosan, the FT-IR,13C NMR, Na+chromatogram and TGA were used to characterize oxidation products, and further to study its antioxidant capability. Results showed that the C-6-hydroxyl of chitosan were selectively oxidised to carboxyl, and other basic structure unchanged, the product is sodium salt of oxidised chitosan; compared to the oxidation product of chitosan with the original, can improve the thermal stability; after standing for 5 min, the oxidation product of chitosan provided an ABTS·+radical scavenging ability of 66.36%, indicate that antioxidant capability of the oxidation product was improved.

Key words:laccase; TEMPO; chitosan; antioxidant capability

文章編號：1001-9731(2016)06-06010-06

* 基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31170548)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目(201510057099)

作者簡介：裴繼誠(1958-)，男，教授，主要研究方向為清潔制漿與木質(zhì)資源綜合利用。

中圖分類號：TB332

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.06.003

收到初稿日期：2015-06-03 收到修改稿日期：2015-10-16 通訊作者：裴繼誠，E-mail: jcpei@tust.edu.cn