李寶秀　方喜生　張　敏　毛海波　關(guān)明媚　劉國龍

1　廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院腫瘤科(廣州 510180) 2　廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(廣州 510310)

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自噬對鼻咽癌細(xì)胞CNE2放療敏感性的調(diào)節(jié)作用

李寶秀1方喜生1張敏2毛海波1關(guān)明媚1劉國龍1

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院腫瘤科(廣州 510180) 2廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(廣州 510310)

【摘要】目的探討自噬激活劑和自噬抑制劑分別對鼻咽癌細(xì)胞CNE2放療敏感性的影響。方法利用RNA干擾技術(shù)使atg5基因沉默，構(gòu)建自噬抑制細(xì)胞模型后，與雷帕霉素、氯喹分別處理的兩組細(xì)胞一起，每天以X射線5Gy照射細(xì)胞，連續(xù)8天觀察各組細(xì)胞的生長狀況，并設(shè)置對照組。以MTT法及克隆集落形成法檢測其細(xì)胞活力，用流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞周期。結(jié)果與對照組相比，其他三組細(xì)胞存活率、克隆形成率、照射后存活率均顯著降低(P<0.05)；細(xì)胞周期檢測除對照組外其他三組細(xì)胞集中在G0/G1期，其他兩個(gè)時(shí)期比G0/G1期相對較少。結(jié)論自噬抑制劑與激活劑和atg5沉默均能為CNE2放療增敏，然而自噬激活劑的增敏效果好于其他，為增敏放療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開辟新的放療增敏途徑。

【關(guān)鍵詞】自噬鼻咽癌放療敏感性雷帕霉素氯喹

自噬(autophagy)是一種細(xì)胞在能量缺乏、代謝等壓力下的自我降解過程[1-2]。自噬不僅具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，過度上調(diào)的自噬作用也可以引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”[3]。放療可誘導(dǎo)自噬，自噬對放療敏感性的調(diào)節(jié)作用尚不清楚[4]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)干預(yù)鼻咽癌自噬后聯(lián)合或單獨(dú)放療對鼻咽癌細(xì)胞的影響，明確鼻咽癌自噬現(xiàn)象與放療的關(guān)系，為增敏放療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開辟新的放療增敏途徑。

1材料與方法

1.1材料與儀器胎牛血清(Hyclone)、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、雷帕霉素、氯喹、RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT粉(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、DNA提取試劑盒、PCR試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、RNAi試劑盒(亞諾法生技股份有限公司)、Rayto RT-6100C酶聯(lián)免疫檢測儀、PCR儀(ABI公司)、三氣培養(yǎng)箱(SANYO公司)、激光共聚焦顯微鏡、直線加速器(西門子公司)、流式細(xì)胞儀分析。

1.2細(xì)胞及其培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供；用加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含10 μg/mL青霉素和10 μg/mL鏈霉素、2 mmol/mL谷氨酰胺)于36℃、7.5%CO2、95%空氣(常氧)飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1RNAi建模自噬相關(guān)基因atg5是自噬延長階段的關(guān)鍵分子。atg5 RNAi包括質(zhì)粒構(gòu)建和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與siRNA。①重組質(zhì)粒構(gòu)建：細(xì)胞基因 DNA抽離確定目的基因；設(shè)計(jì)特異性引物；PCR擴(kuò)增相應(yīng)片段；目的片段的回收純化；酶切反應(yīng)；連接反應(yīng)；構(gòu)建質(zhì)粒；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；質(zhì)粒小量提??；重組質(zhì)粒測序鑒定；質(zhì)粒大量提取。②質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與siRNA：在6孔板中每孔接種 1×105個(gè)CNE2鼻咽癌細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長至40%～60%融合期。取重組DNA 4 mg及脂質(zhì)體10 mL轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后用選擇性培基(G418濃度: 1～3 d為250 mg/L以后為550 mg/L)篩選抗性克隆18 d后挑單個(gè)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)建成穩(wěn)定傳代的atg5 RNAi轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組對照組、mTOR抑制劑雷帕霉素+放療組、氯喹+放療組及atg5 RNAi+放療組。將處于對數(shù)生長期的CNE2細(xì)胞傳代離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，90 μL/孔。4組處理分別為放療組，雷帕霉素聯(lián)合放療組，氯喹聯(lián)合放療組及atg5 RNAi細(xì)胞聯(lián)合放療組。分組將細(xì)胞各取1×104個(gè)接種于24孔板內(nèi)每隔24h消化3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)每孔計(jì)數(shù)3遍取均值；放療采用加速器6mv X光子線5Gy/次×1～2次。共記數(shù)8 d的細(xì)胞生長情況，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪出生長曲線。

1.3.3四唑鹽(MTT)比色法檢測細(xì)胞活力按細(xì)胞培養(yǎng)步驟操作Rayto RT-6100C酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490 nm波長處的吸光度A值。軟瓊脂集落形成：配制5 g/L的底層瓊脂凝固后將含單細(xì)胞的3.3 g/L 頂層瓊脂培養(yǎng)液接種于底層瓊脂上每種細(xì)胞接種5皿接種密度為2.0×104細(xì)胞/平皿。在含7.5% CO2的37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d計(jì)算平均集落形成率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，照射后存活率(SF)=照射后每孔集落形成數(shù)/對照組集落形成數(shù)×100%。

1.3.4流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期取生長狀態(tài)良好融合至70%～80%的各組細(xì)胞PBS洗滌兩次，乙醇固定調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×109/L加入PI染液流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞群體在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的分布比例。

2結(jié)果

2.1四組細(xì)胞自噬活性對放療敏感性的影響對照組CNE2細(xì)胞存活率為98.23%，雷帕霉素、氯喹和atg5 RNAi組細(xì)胞存活率分別是37.8%、66.10%和58.32%，實(shí)驗(yàn)組CNE2細(xì)胞存活率低于對照組(F=32.06，P<0.001)；對照組CNE2細(xì)胞克隆形成率為82.31%，雷帕霉素、氯喹和atg5 RNAi組細(xì)胞克隆形成率分別是17.84%、40.70%和39.98%，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成率均低于對照組(F=45.27，P<0.001)；而CNE2細(xì)胞照射后的存活率(71.28%)也高于雷帕霉素、氯喹和atg5 RNAi組的照射后存活率(分別是28.54%、42.87%以及43.53%)(F=20.65，P<0.001)。見表1。雷帕霉素比氯喹和atg5基因沉默兩組下降更明顯，表明其能更有效提升CNE2放療敏感性，見圖1。

表1　不同處理的四組CNE2細(xì)胞放療后存活率、克隆形成率和照射后存活率比較　%

圖1　四組CNE2細(xì)胞存活率、

2.2 各組細(xì)胞周期細(xì)胞分布情況 從G0/G1期到S期和G2/M期，各組細(xì)胞分布比例呈下降趨勢(F=26.72，P<0.001)；而不同組間細(xì)胞分布比例差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.34，P=0.021)；而時(shí)間與組別之間交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.51，P=0.032)；雷帕霉素組不同時(shí)期下降速度最快，而對照組下降速率較慢。結(jié)果見表2及圖2。

表2實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞周期細(xì)胞分布比例 %

組別G0/G1期S期G2/M期雷帕霉素組93.57±1.685.24±0.392.96±0.57氯喹組86.73±3.3512.46±2.651.18±0.39atg5RNAi組62.82±1.7228.54±6.947.46±0.64對照組39.26±5.4135.37±1.4625.12±2.13

3討論

鼻咽癌是我國常見癌癥之一，全世界鼻咽癌病例中80%發(fā)生于我國。廣東是全世界鼻咽癌發(fā)病率最高的地區(qū)，占全國的60%，因而鼻咽癌又稱為“廣東癌”[5-7]。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段。Ⅰ-Ⅳ期鼻咽癌的5年生存率平均在50%左右，而中晚期者僅為20%～30%，20%的鼻咽癌經(jīng)過以放射治療為主的綜合治療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)。鼻咽癌放療后的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是病人死亡的主要原因，因此除了要改進(jìn)放療技術(shù)，應(yīng)當(dāng)從鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的新分子機(jī)制和放射抵抗機(jī)制著手[8]，目前自噬已經(jīng)成為國際上生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

圖2　實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞周期細(xì)胞分布比例(%)

有研究表明，PmTOR是自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可感受細(xì)胞內(nèi)氨基酸和ATP變化，控制細(xì)胞自噬[9]。PmTOR主要通過PI3K/AKT/mTOR途徑抑制自噬，促進(jìn)腫瘤發(fā)展：如胰島素、生長因子等通過酪氨酸激酶受體，激活ClassⅠPI3K,使PIP被磷酸化為PIP3，后者激活A(yù)KT，活化的AKT可以磷酸化TSC2，增加具有mTOR結(jié)合活性的GTP-Rheb，使mTOR活性增強(qiáng)，抑制自噬的發(fā)生。從而雷帕霉素能抑制mTOR活性，因而促進(jìn)細(xì)胞自噬[10]。在本研究中，雷帕霉素抑制mTOR活性強(qiáng)于其他組，且隨時(shí)期的變化而迅速抑制到較低水平，與其他研究一致[9-10]。我們可以認(rèn)為mTOR抑制劑雷帕霉素能通過促進(jìn)自噬增強(qiáng)CNE2的放療敏感性。

氯喹(Chloroquine，CQ)為4-氨基喹啉類，最初用來治療瘧疾，以后用途逐漸擴(kuò)大。1951年，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，有一定效果。此藥還可以用于肝阿米巴病、華支睪吸蟲病、肺吸蟲病、結(jié)締組織病(盤狀紅斑狼瘡及系統(tǒng)性紅斑狼瘡)及光敏性疾患如日盼紅斑癥等。近來的研究表明CQ通過抑制自噬、促進(jìn)凋亡等機(jī)制逆轉(zhuǎn)腫瘤放化療抵抗及增加免疫治療敏感性從而抗腫瘤[8,11]。而自噬相關(guān)基因atg5是自噬延長階段的關(guān)鍵分子，atg5復(fù)合物對自噬泡的形成至關(guān)重要，是自噬過程中膜的延伸所必需的，而且LC3-II的形成依賴于atg12-atg5復(fù)合物,干擾atg5基因表達(dá)就可以阻滯自噬的形成[10]。有研究表明氯喹與核蛋白有較強(qiáng)的親和力，喹啉環(huán)上帶負(fù)電的7—氯基與DNA的鳥嘌呤上的2—氨基吸引，使氯喹插入到DNA的雙螺旋之間，阻礙DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[12]。本研究也表明氯喹與核蛋白組均能抑制mTOR活性，其抑制效果兩組接近。

雖然兩組的抑制效果接近，但本研究表明氯喹的抑制速度要強(qiáng)于atg5 RNAi組。這可能是因?yàn)槁揉c核蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合力，更容易通過喹啉環(huán)上帶負(fù)電的7—氯基插入到DNA的雙螺旋兩股之間與DNA形成復(fù)合物，從而更快的阻止DNA的復(fù)制與RNA轉(zhuǎn)錄。有研究表明聯(lián)合使用氯喹和atg5 RNAi可更近一步增強(qiáng)CNE2的放療敏感性[13]，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)干預(yù)鼻咽癌自噬后聯(lián)合或單獨(dú)放療對鼻咽癌細(xì)胞的影響，表明增強(qiáng)和抑制自噬作用對鼻咽癌細(xì)胞CNE2均能增加放療敏感性，有效為增敏放療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開辟新的放療增敏途徑并闡明自噬的分子機(jī)制在鼻咽癌治療中的作用，為針對自噬信號(hào)通路的靶向治療手段的設(shè)計(jì)及放療抗拒的克服提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The regulatory effects of autophagy to the CNE2 cells radio-sensitization

LiBaoxiu,FangXisheng,MaoHaibo,etal.

DepartmentofOncology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China

ZhangMin.

SchoolofPublicHealth,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510310,China

【Abstract】ObjectiveThis study aimed to investigate the autophagy activators and inhibitors effects in nasopharyngeal CNE2 cells radiotherapy sensitization.MethodsAtg5 gene silencing by RNA interference technology, two groups of cell autophagy inhibition were built by rapamycin and chloroquine respectively. Then 5Gy x-ray irradiation of cells was taken every day, after 8 days in a row in each group of cell growth and setting a control group. The cell viability was clonaled colony formation by MTT method assay and cell cycle by flow cytometry analysis.ResultsThe three cell group survival rate, colony-forming rate and survival after irradiation were significantly lower (P<0.05) than the control group. Detection of cell cycle in addition to control three other groups concentrated in the G0/G1 period.That of two other periods was relatively fewer than that of the G0/G1 period. Conclusion Autophagy inhibitors， activators and atg5 silence improved the radio-sensitization to CNE2. The autophagy activator group improving the sensitivity was better than the others.This study provided evidence to sensitive radiotherapy, explored a new promising radiosensitization ways.

【Key words】Aotophagy; CNE2; Radio-sensitization；Rapamycin；Chloroquine

基金項(xiàng)目：2012年廣東省科技計(jì)劃基金(01078650166731031)；2011年度廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2011469) ;2011年度廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目(201102A213075)

通信作者：劉國龍，E-mail:liugl@fimmu.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.03.002

(收稿日期：2016- 03- 25)