余丹純　聶玉強(qiáng)　賈　林　黃耀星　孫小娟

廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(廣州 511457)

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胃癌組織miR-9的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

余丹純聶玉強(qiáng)賈林黃耀星孫小娟

廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(廣州 511457)

【摘要】目的觀察miR-9在胃癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理的相關(guān)性。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)28例胃癌及正常胃組織中miR-9的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)情況與臨床病理資料的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織miR-9的表達(dá)水平[0.0078(0.0031～0.0142)]顯著低于相應(yīng)正常胃組織[0.0177(0.0084～0.0311),P<0.05]，尤其是伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者[0.0021(0.0006～0.0685)]miR-9表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論胃癌組織中miR-9低表達(dá)，且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胃腫瘤臨床病理學(xué)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)miR-9

微小RNA(miRNA)是真核生物中一類22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在進(jìn)化上具有高度保守性，能通過與靶基因mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶基因m-RNA降解或抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，作為一類潛在的癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[1-3]，成為近年研究的熱點(diǎn)。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在神經(jīng)腫瘤、乳腺癌、宮頸癌、食道癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[4-10]。由于miRNA具有組織特異性，不同細(xì)胞來源的腫瘤可能會(huì)有不同的miRNA上調(diào)或下調(diào)[11]，目前尚未有關(guān)于miR-9表達(dá)與胃癌關(guān)系的研究報(bào)道，本研究擬探討miR-9在胃癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1標(biāo)本收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院2012年11月—2013年11月外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的28例胃癌患者，所有患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。手術(shù)標(biāo)本取新鮮胃癌及遠(yuǎn)離癌灶至少5cm的正常黏膜組織各1塊，沖洗干凈后立即置于液氮中保存。正常黏膜組織進(jìn)行病理學(xué)檢查未見癌細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.2臨床資料采集所有入組患者的臨床資料，包括性別、年齡、影像學(xué)檢查(CT或MR)、術(shù)中所見及術(shù)后病理結(jié)果。其中男21例，女7例，平均年齡(58.3±13.1)歲；高分化腺癌3例，中分化腺癌9例，低分化腺癌16例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例；按照胃癌TNM分期方法：Ⅰ期2例，Ⅱ期6例，Ⅲ期9例，Ⅳ期11例。

1.3總RNA的提取鑒定和cDNA合成及保存將100 mg組織于液氮中研碎，加入1 mL Trizol(美國(guó) Invitrogen)，按照說明書提取RNA后用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，并行電泳鑒定，置于-80°C保存?zhèn)溆?。每個(gè)標(biāo)本分別取2 μg總RNA，按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(EXIQON)說明書操作合成第一鏈cDNA，合成cDNA置于-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì)及合成在miRNA Base數(shù)據(jù)庫和Gene Bank數(shù)據(jù)庫中查找miR-9及內(nèi)參基因U6的基因序列，使用primer-Express 2.0軟件設(shè)計(jì)引物，由EXIQON公司合成。miR-9上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3′。U6上游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物：5′-GGAACG-CTTCACGAATTTG-3′。

1.5qRT-PCR檢測(cè)miR-9的表達(dá)水平按照qRT-PCR試劑盒(丹麥 EXIQON)使用說明書，在MJR option 2熒光定量PCR儀上同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品及樣品U6及miR-9表達(dá)水平測(cè)定。反應(yīng)條件：95°C 5 min預(yù)變性，然后95°C 10 s，62°C 45 s，72°C 10 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)時(shí)定量PCR儀直接計(jì)算出每一樣品各基因的表達(dá)量(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均作3個(gè)復(fù)孔，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析)。為了校準(zhǔn)標(biāo)本間RNA治療和逆轉(zhuǎn)錄效率差異，對(duì)每一樣品檢測(cè)所得miR-9的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。miR-9標(biāo)化表達(dá)量=同一份標(biāo)本miR-9表達(dá)量/U6表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1總RNA的鑒定每份組織標(biāo)本提取的總RNA濃度5～11 g/L，A260/A280值均在1.85～2.00之間。紫外線下在1%瓊脂糖凝膠上可見28S、18S、5S 3條帶，28S和18S的亮度比約為1.5∶1～2∶1，5S條帶比較淡，見圖1。表明提取的總RNA純度高，降解少，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-9的表達(dá)水平癌組織中miR-9中位表達(dá)量0.0078(0.0031～0.0142)顯著低于相應(yīng)正常胃組織0.0177(0.0084～0.0311)(Z=-2.733,P=0.008)。

2.3胃癌組織中miR-9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系miR-9的表達(dá)下調(diào)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度和TNM分期無關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表1。

圖1　組織總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

3討論

胃癌(Gastric Cacinoma)是最常見的消化道惡性腫瘤，占全球癌癥死亡原因的第二位。盡管近年來治療手段不斷改進(jìn)，早期胃癌5年生存率可達(dá)90%，但晚期胃癌5年生存率僅為14%，其治療效果取決于腫瘤大小、分期、病理類型、侵襲和轉(zhuǎn)移等。因此，尋找特異性的分子標(biāo)記物，對(duì)明確早期腫瘤的生物學(xué)特性，實(shí)施針對(duì)性治療有著重要意義。

近年來miRNA在人類惡性腫瘤性疾病中的作用受到高度的重視。在腫瘤組織中染色體常發(fā)生缺失、增加或重排現(xiàn)象，而miRNA位于染色體的脆性位點(diǎn)，因此異常表達(dá)的miRNA可能在腫瘤形成中扮演重要角色，可能是控制細(xì)胞增殖和凋亡的抑癌基因或致癌基因[12-13]。miRNA表達(dá)的改變可以導(dǎo)致遺傳信息表達(dá)的改變從而導(dǎo)致相應(yīng)的病理生理狀態(tài)，而處于一定病理生理狀態(tài)的組織常伴有特定的miRNA表達(dá)[14]。對(duì)腫瘤miRNA表達(dá)的研究有助于多種癌癥的分型和預(yù)后判斷[15]。尋找并研究特異性的miRNA及其靶基因的表達(dá)有助于胃癌的分型和預(yù)后判斷，可為治療提供新的思路。

表1　胃癌組織中miR-9表達(dá)與

注：M(Q25～Q75)分別是miR-9標(biāo)化表達(dá)量的中位數(shù)及上下四分位數(shù)，*P<0.05

人miR-9有23個(gè)核苷酸，有3種類型：miR-9-1、miR-9-2和miR-9-3，分別定位于1q22、5q14.3、15q26.1，具有促癌和抑癌雙向調(diào)節(jié)作用，在不同細(xì)胞來源的腫瘤組織其表達(dá)及作用不盡相同。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在神經(jīng)腫瘤、乳腺癌、宮頸癌、食道癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[4-10]。NASS D等[4]還發(fā)現(xiàn)miR-9在原發(fā)性腦腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，而在其他腦轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)明顯下調(diào)，對(duì)于區(qū)別是否原發(fā)性腦腫瘤具有重要的意義。而在宮頸癌患者中，miR-9的表達(dá)與其生存率有關(guān)[6]。目前尚未有關(guān)于miR-9在胃癌組織中表達(dá)情況的報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織miR-9的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)正常胃組織，通過對(duì)miR-9的表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-9表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示miR-9低表達(dá)與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。miR-9低表達(dá)也與黑色素瘤[16]和食管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-9可以作為評(píng)估侵襲能力的指標(biāo)。人類腫瘤組織CpG島啟動(dòng)子區(qū)域甲基化是抑癌miRNA表達(dá)缺失的重要機(jī)制之一[17]，而表達(dá)miR-9的三個(gè)基因座位均具有CpG島。在惡性黑色素瘤中可見到miR-9基因位點(diǎn)高甲基化現(xiàn)象[18]，胃癌組織中miR-9表達(dá)下調(diào)表達(dá)也可能與miR-9的異常甲基化有關(guān)，有待我們更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

總之，胃癌組織中miR-9低表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是一有潛在價(jià)值的特異性miRNA，可能為將來胃癌的靶向治療提供新方向。

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The correlation between miR-9 expression and clinicopathology in gastric carcinoma

YuDanchun,NieYuqiang,JiaLin,etal.

DepartmentofGastroenterology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,Guangzhou510180,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between the level of miR-9 expression and clinicopathology in gastric carcinoma.MethodsThe expression of miR-9 in 28 cases of gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues were detected by quantitative real-time PCR, and the relationship between the expression and clinicopathology was analyzed.ResultsThe expression of miR-9 expression in gastric carcinoma tissues [0.0078(0.0031～0.0142)] was significantly lower compared with the corresponding normal gastric tissues [0.0177(0.0084～0.0311),P<0.05], especially in lymph node-invasive carcinoma [0.0021(0.0006～0.0685)].ConclusionmiR-9 was down regulated in gastric cancer tissues, which was significantly associated with lymph node metastasis.

【Key words】Gastric neoplasms; Clinicopathology; Reverse transcriptase polymerase chain reaction; miR-9

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.03.003

(收稿日期：2015- 02-15)