劉道泉，吳波平（. 福州市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，福建福州　350003；. 福建省動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，福建福州　350003）

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一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒野毒株的基因序列分析

劉道泉1，吳波平2
（1. 福州市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，福建福州350003；2. 福建省動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，福建福州350003）

摘要：為了解福建省福州市的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的分子流行病學(xué)情況，對(duì)從一例豬繁殖與呼吸綜合征臨床疑似病例中分離的PRRSV，特異性擴(kuò)增了其ORF3、ORF5、NSP2片段，然后進(jìn)行基因測(cè)序和分析。結(jié)果表明：該毒株NSP2編碼區(qū)、ORF3基因、ORF5基因與國(guó)內(nèi)流行的PRRSV變異株核苷酸同源性分別在94.9%~97.7%、95.2%~97.7%和96.1%~96.7%。由此推斷，該株由國(guó)內(nèi)流行的變異毒株演化而來(lái)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；基因序列分析；進(jìn)化樹(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒之一，可引起母豬繁殖障礙，斷奶仔豬發(fā)生肺炎、生長(zhǎng)遲緩以及高死亡率[1-3]。感染豬只通過(guò)唾液、鼻分泌物、尿液、精液以及糞便排毒[4]；懷孕后期感染母豬可通過(guò)乳汁排毒；公豬精液帶毒期可達(dá)90 d。PRRSV具有高度宿主依賴(lài)性，主要在豬肺泡巨噬細(xì)胞以及其他組織巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)，也能在睪丸細(xì)胞中生長(zhǎng)[5-6]。由于PRRSV是一種小RNA病毒，其基因組易于變異且不同毒株僅有部分具有交叉保護(hù)作用，因此基因測(cè)序成為PRRSV的常規(guī)診斷方法，同時(shí)對(duì)疫苗毒株的選擇有重要意義[7]。NSP2除了在病毒的復(fù)制中發(fā)揮作用外，其含有大量抗原決定簇，可以被感染宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別[8]。

研究表明，全球大多數(shù)生豬養(yǎng)殖國(guó)家中普遍存在PRRSV重組株，其可產(chǎn)生嵌合病毒株[9-10]。境外新毒株的傳入已造成不少豬場(chǎng)感染和發(fā)病，成為近年來(lái)的流行毒株之一，NADC30-like毒株已在我國(guó)多個(gè)地區(qū)流行和傳播[11]。當(dāng)前由于盲目使用、長(zhǎng)時(shí)間使用、高頻度免疫而導(dǎo)致豬場(chǎng)出現(xiàn)臨床發(fā)病、豬群不穩(wěn)定的現(xiàn)象十分普遍，許多豬場(chǎng)的 藍(lán)耳病已由疫苗毒所致，而非野毒感染[11-13]。

當(dāng)前由于豬場(chǎng)生物安全難以做到位，以及高致病性減毒活疫苗的誤用和不正確使用，使得豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株的多樣性急劇攀升、變異程度加快，出現(xiàn)了不少新的毒株、重組毒株。其與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒野毒株在豬場(chǎng)共存，難以區(qū)分是野毒感染還是疫苗毒感染[11，14-15]。為此，進(jìn)行分離株的基因測(cè)序分析是非常有必要的，這不僅為進(jìn)一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒的生物學(xué)信息奠定基礎(chǔ)，也為探索有效的防控方案奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1病料

病料來(lái)源于福州市某規(guī)模化豬場(chǎng)免疫過(guò)豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）疫苗（經(jīng)典株）的50~60日齡保育豬。臨床表現(xiàn)為體溫升高至41℃左右，腹式呼吸，部分出現(xiàn)腹瀉癥狀；剖檢可見(jiàn)肺間質(zhì)增寬、淤血，脾臟腫大梗死，淋巴結(jié)腫大出血等。選擇臨床癥狀典型的病豬，采集扁桃體、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、血液等樣品。

1.2主要試劑

Premix Ex Taq（TaKaRa Ex Taq Version 2.0 plus dye）、Primer Script One Step RT-PCR Kit ver.2、6 Loading buffer、分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 Marker、克隆載體pMD-18T Vector，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Hight Pure Viral RNA Kit，購(gòu)自Roche；PRRSV熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京生科尚儀；瓊脂糖（Agarose）、感受態(tài)細(xì)胞DH5α大腸桿菌（Escherichia coli），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Goldview染料，購(gòu)自賽百盛；膠回收（小量）試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，以及常規(guī)化學(xué)試劑、耗材和藥品，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3病毒核酸的提取

采集患病豬只的肺部組織、肺門(mén)淋巴結(jié)，充分剪碎后置于2 mL離心管中，加入800 μL高鹽溶液；用漩渦振蕩器充分震蕩混勻后，反復(fù)凍融3次，離心3 000 rpm 2 min，取上清。按照動(dòng)物組織基因組RNA提取試劑盒（Hight Pure Viral RNA Kit）操作方法提取組織RNA，洗脫核酸，后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì)

參考楊漢春等[8-9]文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)引物并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5病毒的檢測(cè)、克隆、測(cè)序和序列分析

PRRSV的檢測(cè)按照北京生科尚儀的方法進(jìn)行。確診為PRRSV陽(yáng)性后，對(duì)ORF3、ORF5、ORF7、NSP2片段進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中Primer Script 1 Step Enyzyme Mix 1 μL、2 1 Step Buffer 12.5 μL、上下游引物（20 μm/mL）各1 μL、DNA模板9.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒Gel Extraction Kit切膠回收后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)選擇8個(gè)克隆，用質(zhì)粒提取試劑盒UNIQ-10提取質(zhì)粒，用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒。隨機(jī)選擇3份陽(yáng)性重組質(zhì)粒送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。用DNAStart軟件，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中收錄的國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比較分析，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2　結(jié)果

2.1目的基因擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用特異性引物，擴(kuò)增出PRRSV ORF3、ORF5、ORF7、NSP2基因片段，大小與預(yù)期相符，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2基因序列的拼接與同源性比較

圖1　 目的片段1%瓊脂糖凝膠電泳

將該毒株（MX-2015）序列測(cè)序結(jié)果，經(jīng)BLAST分析驗(yàn)證后，和GenBank中登錄的PRRSV代表株進(jìn)行核苷酸同源性比較。其ORF3基因核苷酸序列長(zhǎng)度為765 bp，編碼255個(gè)氨基酸；其核苷酸與其他毒株比對(duì)，發(fā)生點(diǎn)狀變異，與國(guó)內(nèi)其他PRRSV變異株核苷酸同源性為97.1%~97.8%，與國(guó)外毒株同源性為62.7%~91.9%，與國(guó)內(nèi)最新分離毒株NADC-30同源性?xún)H為84.1%（圖2~3）。

圖2　PRRSV ORF3核苷酸序列比對(duì)

圖3　PRRSV ORF3核苷酸同源性比較

圖4　PRRSV ORF5核苷酸序列比對(duì)

圖5　PRRSV ORF5核苷酸同源性比較

其ORF5核苷酸序列長(zhǎng)度為603 bp，編碼201個(gè)氨基酸，核苷酸序列在第87~150位發(fā)生明顯點(diǎn)狀突變，與國(guó)內(nèi)其他PRRSV變異株核苷酸同源性為97.2%~97.7%，與JXA1同源性最高，為97.7%，同國(guó)內(nèi)經(jīng)典株CH-1a株同源性為87.7%，同國(guó)外分離株同源性為63.3%~90.7%，與國(guó)內(nèi)最新分離毒株核苷酸同源性為85.4%（圖4~5）。

其N(xiāo)SP2核苷酸序列長(zhǎng)度為2 827 bp，與其他流行毒株的核苷酸比對(duì)，在第570~640位發(fā)生明顯點(diǎn)狀突變，與國(guó)內(nèi)其他PRRSV變異株核苷酸同源性為96.1%~96.7%，同國(guó)內(nèi)經(jīng)典株CH-1a株同源性為89.9%，同國(guó)外分離株同源性為52%~86.5%（圖6~7）。

3　討論

PRRSV是世界范圍內(nèi)影響生豬生產(chǎn)的最重要病毒之一，可產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生問(wèn)題[16]。關(guān)于PRRSV的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題源于其基因多樣性，其被認(rèn)為可直接影響免疫生物學(xué)、流行病學(xué)、診斷和疫苗效果。造成這種基因多樣性的一個(gè)重要原因是不同病毒株之間的重組[17-19]。一直以來(lái)，PRRSV NSP2、GP5和GP3的變異特征為該毒株分子衍化分析的重要指標(biāo)[20]，故本研究對(duì)一株P(guān)RRSV毒株與毒株（MX-2015）的NSP2、ORF5、ORF3進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，該毒株NSP2編碼區(qū)、ORF3基因、ORF5基因與我國(guó)主要的PRRSV變異株核苷酸同源性分別在94.9%~97.7%、95.2%~97.7%、96.1%~96.7%， 與國(guó)外分離株的核苷酸同源性分別為 62.7%~91.9%、63.3%~90.7%、52%~86.5%。

圖6　 PRRSV NSP2核苷酸序列比對(duì)

圖7　 PRRSV NSP2核苷酸同源性比較

通過(guò)遺傳進(jìn)化樹(shù)的分析比對(duì)， MX-2015株與國(guó)內(nèi)PRRSV變異株JX株、TJ株、HUN株、GD株等均處于同一分支，推斷該毒株仍是由這些毒株變異演化而來(lái)。本試驗(yàn)結(jié)果豐富了福建省PRRSV的基因組數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]安同慶. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒與宿主細(xì)胞受體之間相互作用的研究及病毒遺傳變異分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[2]高志強(qiáng). 豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組分子遺傳特征分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[3]董建國(guó). 豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9與宿主細(xì)胞蛋白pRb相互作用的分子機(jī)制[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[4]韋天超. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒人工感染模型的建立及其部分生物學(xué)特性研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

[5]劉燦. 豬繁殖與呼吸綜合征高致病性毒株的致弱評(píng)價(jià)與相關(guān)分子機(jī)制研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[6]郝曉芳，周艷君，田志軍，等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007（9）：704-709.

[7]冷雪. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離鑒定、遺傳變異及致病性分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[8]希尼尼根. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5核酸疫苗的研究[D]. 成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[9]王鳳雪. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2對(duì)病毒致弱及復(fù)制影響的研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[10]馬平. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒國(guó)內(nèi)流行毒株的分離、鑒定及其遺傳變異分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

[11] 周磊，楊漢春，姜平，等. 豬繁殖與呼吸綜合征綜合防控技術(shù)與應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜牧雜志， 2015，51 6）：62-67.

[12]蔡雪輝. PRRSV流行毒株NSP2遺傳變異分析及其活疫苗的安全性評(píng)價(jià)[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2012.

[13]江云波. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒新型基因工程疫苗研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[14]徐彥召. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒致弱毒株NSP2復(fù)制非必需區(qū)的鑒定及其表達(dá)外源基因的研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[15]魏津. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）國(guó)家參考品的研制及定值方法的建立[D].北京：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2013.

[16]周峰. 2012-2013年河南地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及河南流行株的分離、鑒定[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[17]程群. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒SHxx13/2013株分離鑒定及致病性分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[18] 魯韋韋. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[19]游一. 規(guī)?；i場(chǎng)豬繁殖與呼吸綜合征綜合防制措施研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[20] 嚴(yán)安. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2基因和ORF5基因變異分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Genetic Analysis on One Wild Strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Liu Daoquan1，Wu Boping2
（1.Fuzhou Animal Disease Control Center，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350003；2. Fujian Provincial Animal Disease Control Center，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350003）

Abstract：In order to understand the molecular epidemiological situation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in Fuzhou city of Fujian province，one virus strain from suspected cases of PRRS was isolated and the ORF3，ORF5 and NSP2 were sequenced. The data showed that the NSP2，ORF3 and ORF5 of this strain shared the nucleotide identity with 94.9%~97.7%，95.2%~97.7% and 96.1%~96.7% respectively，compared with main PRRSV strains in China. Therefore， it was inferred that this strain was evolved from popular variant strains in China.

Key words：PRSSV；genetic analysis；phylogenetic tree

中圖分類(lèi)號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）07-0086-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.026

基金項(xiàng)目：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（2014-01）

通訊作者：吳波平