王建昌，王金鳳，劉立兵，孫曉霞，袁萬哲（.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，河北石家莊　05005；.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定　0700）

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非洲豬瘟病毒RPA等溫檢測方法的建立

王建昌1，王金鳳1，劉立兵1，孫曉霞1，袁萬哲2
（1.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，河北石家莊050051；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定071001）

摘要：為建立一種簡單、快速的非洲豬瘟病毒（ASFV）分子檢測方法，基于ASFV P72基因保守序列，設(shè)計(jì)并合成引物，建立了一種ASFV重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）等溫檢測方法。結(jié)果表明，所建立的RPA方法在38℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)30 min，即可實(shí)現(xiàn)對目的片段的有效擴(kuò)增；以包含ASFV P72基因的ORF質(zhì)粒為模板，RPA的檢測限達(dá)到102copies，同世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測限一致，但比OIE推薦方法的檢測限高10倍；RPA僅特異性擴(kuò)增ASFV P72基因，對FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因組cDNA或DNA沒有擴(kuò)增。本研究所建立的RPA方法操作簡單、反應(yīng)快速、檢測成本低、結(jié)果確實(shí)可靠，為非洲豬瘟的一線防控提供了一種新的、可靠的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；分子檢測；等溫?cái)U(kuò)增；聚合酶重組酶擴(kuò)增；快速

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種烈性、高度接觸性傳染病[1]。ASF具有高發(fā)病率、高死亡率特點(diǎn)，一旦發(fā)生，經(jīng)濟(jì)損失巨大。再加上目前對其缺乏有效疫苗和特異性治療手段，使ASF成為目前危害養(yǎng)豬業(yè)的最嚴(yán)重疫病之一。ASFV是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）唯一成員，也是目前已知唯一的DNA蟲媒病毒[1]。ASFV基因組為線性dsDNA分子，大小為170~193 kb，編碼蛋白在151~167個(gè)之間[2]。通過對病毒VP72基因C末端測序，將目前分離的ASFV分為22個(gè)基因型[3]。

目前對ASF的控制只能依賴于快速的實(shí)驗(yàn)室診斷、對發(fā)病動物的捕殺，以及采取有效的檢疫措施和嚴(yán)格的衛(wèi)生措施。ASFV的快速檢測對于控制ASF，防止其造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，具有極其重要的意義。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)建立了多種具有不同特異性和敏感性的ASFV檢測方法，如PCR[4]、real-time PCR[5]、LAMP[6]等。但上述方法或者需要昂貴的儀器設(shè)備、技術(shù)嫻熟的技術(shù)人員，比較費(fèi)時(shí)，或者需要復(fù)雜的引物和探針設(shè)計(jì)，反應(yīng)試劑需要冷鏈運(yùn)輸和保存，從而不能有效應(yīng)用于野外現(xiàn)場檢測。

重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）是一種等溫基因擴(kuò)增技術(shù)[7]。重組酶結(jié)合引物形成蛋白-DNA混合物并啟動尋找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，則會引發(fā)鏈置換反應(yīng)。引物結(jié)合到對應(yīng)模板上，聚合酶進(jìn)而從引物3 末端開始啟動DNA合成。同PCR一樣，兩條引物可以啟動對靶基因的幾何級數(shù)擴(kuò)增。RPA反應(yīng)體系中，對引物和探針堿基突變具有較強(qiáng)的耐受性。目前表明在引物9個(gè)堿基突變后，RPA反應(yīng)依然可以順利進(jìn)行[8]。目前RPA已經(jīng)在一系列病原微生物的分子檢測中得到應(yīng)用，如結(jié)核分枝桿菌[9]、口蹄疫病毒[10]、犬細(xì)小病毒[11]等。但是未見RPA技術(shù)在ASFV檢測中的應(yīng)用。

目前ASF在俄羅斯持續(xù)存在和蔓延，在非洲國家也不斷發(fā)生。隨著中非貿(mào)易以及聯(lián)系的進(jìn)一步加強(qiáng)，非洲豬瘟傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)將進(jìn)一步增加。因此，建立一種簡便、快速、有效的ASFV RPA檢測方法，對于我國ASF的監(jiān)控具有重要意義。

1　材料與方法

1.1主要試劑與設(shè)備

1.1.1主要試劑。TwistAmpTMDNA amplification kit，購自英國TwistDx公司；病毒DNA提取試劑盒、DNA 純化回收試劑盒、2 Taq PCR MasterMix，均購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit、Premix Ex Taq，均購自Takara公司。1.1.2 主要設(shè)備。T-Gradient梯度PCR儀（MCO-18AIC），德國Biometra公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500），美國ABI公司生產(chǎn)；核酸蛋白分析儀（BioPhotometer Plus），德國Eppendorf公司生產(chǎn)；核酸電泳儀（PowerPac Basic），美國Bio-rad公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)（Fusion Fx7），法國VIBER LOURMAT公司生產(chǎn)。

1.2病毒株與臨床樣品

PRRSV cDNA和PRV、PCV-2 基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存； CSFV 基因組RNA提取自瑞普商品化兔脾淋活疫苗；O型FMDV基因組RNA提取自蘭州獸醫(yī)研究所商品化試劑盒抗原。20份臨床樣品包括全血、淋巴結(jié)、脾、肺均來自河北不同地區(qū)養(yǎng)豬場。

1.3病毒RNA反轉(zhuǎn)錄及臨床樣品病毒DNA提取

按照Takara first strand cDNA合成試劑盒使用說明，將CSFV、FMDV基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并測定其濃度；按照天根病毒DNA提取試劑盒使用說明，提取臨床樣品病毒DNA。所有病毒DNA和cDNA模板保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4ASFV P72基因重組質(zhì)粒的合成及拷貝數(shù)確定

根據(jù)Genbank中ASFV（AY578706）參考序列，確定P72基因（1 941 bp）序列信息，由上海生工合成并克隆至pUC57載體，命名為pUC57-P72。將pUC57-P72質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測定濃度。使用OIE推薦的PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法[12]對合成質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，同時(shí)送上海生工進(jìn)行測序。

根據(jù)下列公式，計(jì)算重組質(zhì)粒pUC57-P72拷貝數(shù)：拷貝數(shù)（copies/μL）=6.02 1023質(zhì)粒濃度（ng/μL） 10-9/（質(zhì)粒堿基數(shù) 660）。

1.5引物設(shè)計(jì)

參 考GenBank中ASFV P72基 因 序 列（AY578706），選擇特異性保守區(qū)域，設(shè)計(jì)RPA引物，目的片段大小為220 bp。同時(shí)合成OIE推薦PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法使用的引物和探針。所有引物和探針均由上海生工合成（表1）。

表1　引物和探針序列

1.6RPA反應(yīng)體系及程序

使用TwistAmp Basic kit配制50 μL RPA反應(yīng)體系，其中RPA-F和RPA-R（均10 μM）各2.4 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，ddH2O 12.2 μL，模板1 μL，280 mM MgAc 2.5 μL。將模板和MgAc之外的所有試劑預(yù)混后轉(zhuǎn)入含有凍干酶制劑的0.2 mL反應(yīng)管中，并充分混勻。將1 μL 模板加入反應(yīng)管中，并將2.5 μL MgAc加在反應(yīng)管蓋中，蓋緊后瞬時(shí)離心并渦旋后，放入38 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min、20 min、30 min和40 min。

使用天根DNA純化試劑盒對RPA產(chǎn)物進(jìn)行純化，取5μL產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.7PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及程序

反應(yīng)體系和程序均按照OIE推薦方法進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光PCR探針的淬滅基團(tuán)由BHQ1替代TAMRA；PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中PCR buffer、DNA聚合酶和dNTPs，分別使用天根公司的2 Taq PCR MasterMix和Takara公 司 的Premix Ex Taq代替。

1.8特異性和敏感性試驗(yàn)

以FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA，以及pUC57-P72為模板，進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定是否出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。將重組質(zhì)粒pUC57-P72進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其濃度在106~100copies/μL之間，并將其作為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定該方法的最低檢測濃度。同時(shí)比較與OIE推薦PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR方法的敏感性。

1.9RPA方法的應(yīng)用

以提取的20份臨床樣品病毒DNA為模板，應(yīng)用建立的RPA方法進(jìn)行ASFV檢測。

2.　結(jié)果

2.1質(zhì)粒的鑒定及拷貝數(shù)計(jì)算

對合成的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果出現(xiàn)一條特異性條帶，大小約257 bp；進(jìn)行real-time PCR鑒定，結(jié)果出現(xiàn)一條特異性擴(kuò)增曲線；測序結(jié)果表明序列同AY578706同源性為100%。

提取重組質(zhì)粒pUC57-P72的濃度為89 ng/ μL，堿基數(shù)為4 651 bp，經(jīng)計(jì)算得知提取質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.7 1010copies/μL。經(jīng)系列倍比稀釋，使pUC57-P72拷貝數(shù)在106~100copies/μL之間。

2.2RPA反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

為 確 定RPA反 應(yīng) 時(shí) 間 ，以 105copies pUC57-P72為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，并進(jìn)行產(chǎn)物分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，38℃下RPA反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，電泳即可獲得一條大小為220 bp、清晰的特異性條帶。對RPA產(chǎn)物條帶進(jìn)行半定量分析，RPA反應(yīng)30 min后條帶約為20 min時(shí)條帶的6倍，而與反應(yīng)40 min后的條帶沒有顯著差異（圖1）。因此本研究的ASFV RPA最佳反應(yīng)時(shí)間確定為30 min。

圖1　ASFV RPA檢測時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

2.3特異性試驗(yàn)

以FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA，以及pUC57-P72為模板，進(jìn)行ASFV RPA檢測，結(jié)果只有pUC57-P72出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，說明該方法具有良好的特異性（圖2）。

2.4敏感性試驗(yàn)

使用106~100copies系列濃度的pUC57-P72，進(jìn)行RPA的敏感性試驗(yàn)，并與OIE推薦方法比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RPA最低可以檢測到2 102copies質(zhì)粒（圖3-A），同OIE推薦的real-time PCR方法一致（圖3-C），而PCR最低僅檢測到2 103copies質(zhì)粒（圖3-B）。

圖2　ASFV RPA檢測方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖3　ASFV 不同檢測方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5臨床樣品的檢測

對保存的20份樣品通過本研究建立的RPA方法，以及OIE推薦的PCR和real-time PCR進(jìn)行ASFV檢測，結(jié)果所有樣品均為陰性。

3　討論

本研究首次報(bào)道了一種新的用于ASFV檢測的RPA等溫檢測方法。目前RPA方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場檢測[10-11]。同PCR方法相比，RPA具有以下優(yōu)勢：第一，試劑使用方便，易于保存。RPA核心試劑以凍干顆粒形式保存，從而避免了冷藏保存和冷鏈運(yùn)輸。第二，RPA反應(yīng)時(shí)間短。RPA一般少于30 min，而PCR反應(yīng)時(shí)間一般需要60 min以上。第三，等溫?cái)U(kuò)增。RPA屬于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，對儀器設(shè)備要求低，一臺水浴鍋即可完成反應(yīng)，不需要昂貴的儀器設(shè)備。這些特點(diǎn)使得本研究建立的RPA方法可以用于現(xiàn)場ASFV快速檢測和診斷。

本研究人工合成ASFV P72基因全長序列并構(gòu)建克隆載體pUC57-P72，以此作為試驗(yàn)的陽性模板。由圖1可以看出，RPA反應(yīng)10 min后，電泳即可得到特異性目的條帶。反應(yīng)時(shí)間延長至20 min后，RPA產(chǎn)物量增加1倍。RPA反應(yīng)30 min和40 min后，產(chǎn)物量約為20 min產(chǎn)物量的6倍，但是兩者之間沒有明顯差異。這是因?yàn)榉磻?yīng)30 min后，反應(yīng)體系中的能量已消耗完，重組酶和聚合酶活性降低或失活。特異性試驗(yàn)表明，所建立的ASFV RPA僅能特異性擴(kuò)增pUC57-P72，而對其他常見重要豬病病毒核酸沒有任何擴(kuò)增。敏感性試驗(yàn)表明，RPA的敏感性同OIE推薦的real-time PCR一致，最低檢測濃度均為102copies，比OIE推薦PCR敏感性高出10倍。三種方法對臨床實(shí)際樣品的檢測結(jié)果一致，均為ASFV陰性。這和我國不存在ASF的事實(shí)一致。

本研究建立的用于檢測ASFV的RPA等溫檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)快速，對儀器設(shè)備要求低，結(jié)果確實(shí)可靠，為我國非洲豬瘟的一線監(jiān)控提供了有效的技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Rapid and Sensitive Detection of African Swine Fever Virus by Recombinase Polymerase Amplification

Wang Jianchang1，Wang Jinfeng1，Liu Libing1，Sun Xiaoxia1，Yuan Wanzhe2
（1.Technical Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang， Hebei 050051；2.College of Veterinary Medicine，Agricultural University of Hebei， Baoding，Hebei 071001）

Abstract：To develop an convenient and rapid molecular diagnostic method for the African swine fever virus（ASFV），the recombinase polymerase amplification（RPA）was developed using primers specific for the conserved region of the ASFV P72 gene. The RPA reaction was performed successfully at 38℃ for 30 min in a water bath. By using recombinant plasmid DNA carrying the P72 gene as template.The results showed that the detection limit of RPA was 102copies of plasmid DNA，which was the same as the real-time PCR recommended by OIE，and it was 10 times more sensitive than it. RPA could not amplify templates of FMDV，CSFV，PRRSV，PRV or PCV-2，demonstrating high specificity.The ASFV RPA developed in the study is simple，rapid，cost-effective and reliable，which can be an novel and reliable tool for the control of ASF.

Key words：African swine fever virus；molecular diagnosis；isothermal amplification；recombinase polymerase amplification；rapid

中圖分類號：S852.65.9.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）07-0078-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.024

通訊作者：袁萬哲