張　娜，王津津，謝艷輝，于　力，李家僑，劉　瑩（. 湛江出入境檢驗檢疫局，廣東湛江　54000；. 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳　58045）

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進口南美白對蝦親蝦急性肝胰腺壞死病的檢測分析

張娜1，王津津2，謝艷輝1，于力2，李家僑1，劉瑩2
（1. 湛江出入境檢驗檢疫局，廣東湛江524000；2. 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳518045）

摘要 ：急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）是一種新發(fā)疫病，對對蝦養(yǎng)殖業(yè)損失巨大。其病原是攜帶毒素質(zhì)粒基因的副溶血弧菌，但具體致病機制仍不清楚。本研究利用國外報道的毒素質(zhì)?；蛱禺愋砸铮瑢σ慌M境南美白對蝦親蝦進行了AHPND檢測。因其PCR的擴增結(jié)果與國外所報道的基因片段一致，初步認定為AHPND陽性。本文對此次檢測的結(jié)果和過程進行了分析，為我國AHPND的檢測提供了分析數(shù)據(jù)。

關健詞：急性肝胰腺壞死；早期死亡綜合癥；毒素質(zhì)粒；PCR擴增

2009年我國首次暴發(fā)急性肝胰腺壞死病（AHPND）[1]，最初被稱為早死綜合癥（EMS）。近幾年來，很多國內(nèi)外學者針對AHPND病原做了很多研究[2-8]。目前的研究資料表明，AHPND病原是一種特異的常見革蘭氏陰性菌——嗜鹽的副溶血性弧菌。其主要致病原因是由于副溶血性弧菌攜帶了PVA-1毒素質(zhì)粒。到目前為止，其致病機制仍不清楚。鑒于該病的危害巨大，目前世界動物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列入水生動物疫病法定報告名錄。

本研究利用針對毒素質(zhì)粒基因的引物，對一批進境南美白對蝦親蝦進行了檢測，發(fā)現(xiàn)親蝦致病性AHPND菌株感染陽性。此次檢測為我國AHPND檢測方法的建立和監(jiān)控工作提供了重要資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料。隨機采集廣東省湛江地區(qū)對蝦養(yǎng)殖場親蝦3尾。rTaq 反應酶、dNTP、DNA 分子量標準物 DL2000、瓊脂糖，均為大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2主要儀器設備。PCR擴增儀（美國ABI 公司）、凝膠成像儀（德國Biometra公司）、高速冷凍離心機（Eppendorf centrifuge 5417R）、電泳儀（DYY-8C，北京市六一儀器廠）。

1.2方法

1.2.1樣品處理。對進境南美白對蝦親蝦活體3尾，取肝胰腺，按1∶10的比例放入1.5% NaCl的TSB培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/m，振蕩培養(yǎng)5~6 h。震蕩結(jié)束后，取菌液放入1.5 mL離心管中，3 000 r/m，離心5 min，棄上清，加PBS懸浮，按照核酸抽提試劑盒的操作提取DNA。

1.2.2PCR擴增初篩。使用質(zhì)粒引物AP3：F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'；R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'。反應體系為：10 PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水補至25 μL。按照以下程序進行擴增：94 ℃5 min，然后進行32次循環(huán)（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃ 5 min，4 ℃ 保溫。

1.2.3nested-PCR擴增。質(zhì)粒AP4-1引物：F1：5'-ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC-3'；R1：5'-ACG ATT TCG ACG TTC CCC AA-3'。 質(zhì)粒AP4-2引物：F2：5'-TTG AGA ATA CGG GAC GTG GG-3'；R2：5'-GTT AGT CAT GTG AGC ACC TTC-3'。反應體系為：10 PCR buffer（Mg2+Plus） 2.5 μL，AP4-1上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水補至25 μL。按照以下程序進行擴增：94 ℃ 2 min；然后進行30次循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90s），72 ℃ 2 min；4 ℃ 保溫。取第一步的PCR產(chǎn)物，進行第二步nested-PCR。反應體系為：10 PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP4-2上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，第一步PCR產(chǎn)物2 μL，加水補至25 μL。按照以下程序進行擴增：94 ℃ 2 min；然后進行25次循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），72℃ 2min；4 ℃ 保溫。

1.2.4質(zhì)粒毒素基因PCR擴增。Pir VP A引物：F：5'- ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT G-3'；R：5'- TTA GTG GTA ATA GAT TGT ACA G-3'。Pir VP B引物：F：5'- GAG CCA GAT ATT GAA AAC ATT TGG-3'；R：5'- CCA CGC AGC GAG TTC TGT AAT GTA-3'。VpPirA-284引物：F：5'- TGA CTA TTC TCA CGA TTG GAC TG-3'；R：5'- CAC GAC TAG CGC CAT TGT TA-3'。VpPirB-392 引物：F：5'-TGA TGA AGT GAT GGG TGC TC-3'；R：5'- TGT AAG CGC CGT TTA ACT CA-3'。每個引物的擴增反應體系分別為：10 PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，各引物的上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水補至25 μL。按照以下程序進行擴增：94 ℃ 5 min；然后進行30次循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s），72 ℃ 2 min；4 ℃ 保溫。

1.2.5擴增產(chǎn)物測序與序列同源性比對。PCR擴增條帶經(jīng)上海英駿生物技術有限公司測序，測序結(jié)果分別與NCBI基因序列庫進行比對。

1.2.6不同保存條件下的組織和菌液PCR擴增實驗比對。肝胰腺組織、肝胰腺增菌液和PBS菌液懸浮液分別在-20 ℃、4 ℃和25 ℃條件下保存3天。同時對保存在25 ℃條件下的增菌液用TSB反復增菌5次，分別同時用AP3特異性引物進行PCR擴增，操作如1.2.3。

1.2.7致病性副溶血弧菌的分離培養(yǎng)。在進行1.2.1樣品處理的同時，取肝胰腺組織在TSA、TCBS和弧菌特異性顯色培養(yǎng)基中劃板，37 ℃，培養(yǎng)20~24 h，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，再PCR擴增。在進行1.2.1獲得肝胰腺組織增菌液之后，取增菌液劃板培養(yǎng)。

2　結(jié)果

2.1PCR擴增初篩結(jié)果

以南美白對蝦親蝦肝胰腺增菌液的DNA為模板，進行AP3引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示一條大小約為333 bp的特異性目的條帶，與預計的大小一致（圖1）。

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料以例數(shù)（n）、百分數(shù)（%）表示，采用x2檢驗；計量資料以“ ±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1　 AP3引物擴增PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2nested-PCR擴增

以AP4引物進行nest-PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，第一步PCR擴增產(chǎn)物1 269 bp，第二步PCR擴增產(chǎn)物230 bp，與預計的大小一致（圖2）。

圖2　 AP4引物擴增PCR產(chǎn)物電泳分析

2.3質(zhì)粒毒素基因PCR擴增

分 別 用PirVPA、PirVPB、VpPirA-284、Vp-PirB-392 引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果與預計的大小一致（圖3）。

2.4擴增產(chǎn)物測序與序列同源性比對

PCR擴增條帶經(jīng)上海英駿生物技術有限公司測序，測序結(jié)果分別與NCBI中基因序列比對。本文擴增的陽性所有片斷都與Lee 等[9]所得到的序列有99.9%的同源性，結(jié)果一致。

2.5致病性副溶血弧菌的分離培養(yǎng)

圖3　 質(zhì)粒毒素引物擴增PCR產(chǎn)物電泳分析

同樣，用肝胰腺的增菌液劃板培養(yǎng)后，隨即挑取30個TCBS上特異性綠色菌落和顯色培養(yǎng)基中呈弧菌特征的粉色菌落，進行PCR擴增，結(jié)果為陰性。

檢測結(jié)果表明，所挑取的這些單菌落都沒有攜帶特異性致病基因，不是致病性副溶血弧菌菌株。

3　討論

2013年，Tran等[4]提出AHPND病原是一種特異的常見革蘭氏陰性菌株——嗜鹽性副溶血弧菌。通過一些未知的致病機制，這一菌株成為致病性菌株，從而誘導感染對蝦出現(xiàn)AHPND的特征性癥狀。Lightner[10]指出所有致病的副溶性弧菌中都包含一種-89序列基因，這可能是引發(fā)病害的關鍵序列。因為它能夠改變DNA序列基因的位置，引發(fā)基因突變，從而誘發(fā)病變。

有研究表明，即使AHPND引起HP細胞大量脫落而進入HP管中，但是在病變位置沒有發(fā)現(xiàn)任何細菌[11]。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)一些觀點，即Tran等提出的AHPND獨特的病理學特征是由分泌毒素引起，即可肉眼觀察到的壞死病變是由一些未知毒素引起的，從而推測AHPND特異性癥狀由PIRAVP 和PIRBVP兩個分泌型毒素引起，并且這兩種蛋白都是由質(zhì)粒PVA1編碼的[2，11-12]。

Lee 等[9]進而對2株AHPND致病菌株純化的質(zhì)粒進行測序（3HP和M1-1），測序結(jié)果顯示兩個菌株都含有一個70 kbp大小的質(zhì)粒，兩個PVA1的序列同源性達到98%~99%。這個AHPND相關質(zhì)粒被命名為PVA1。此質(zhì)粒上帶有與光桿菌同源的昆蟲相關的毒素（“Photorhabdus insectrelatedPir toxins，PirA and PirB）[12]。在自然缺乏或是基因刪除此Pir毒素的試驗中，致病株明顯失去致病能力，所以副溶血弧菌的Pir毒素是引起AHPND的關鍵。然而PVA1質(zhì)粒是如何進入對蝦體內(nèi)的，目前尚不太清楚。

經(jīng)過序列比對，本研究擴增的所有陽性片斷都與Lee等所得到的序列有99.9%的同源性，結(jié)果一致，說明本研究采用的陽性菌株檢測方法與Lee等所提出的檢測方法可以相互對應，可以用毒素質(zhì)粒基因進行病原檢測。

本研究在進行肝胰腺菌株和增菌液劃板培養(yǎng)時，所挑取的TCBS和顯色培養(yǎng)基中的共60個單菌落都不是致病性副溶性弧菌菌株。這提示非致病性副溶血弧菌在肝胰腺中廣泛和大量存在，與致病性副溶血弧菌菌株一起存活。

本研究對肝胰腺組織不進行增菌培養(yǎng)而直接抽提DNA進行PCR擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直接進行組織抽提沒有檢出陽性，與增菌后的菌液PCR檢測結(jié)果相比，敏感性非常低，所以在病原檢測時應選擇肝胰腺增菌后的菌液。

OIE在《水生動物疾病診斷手冊》關于AHPND一章的征求意見稿中，曾提出只有需要分離出菌株后，才能確診為陽性；隨后2016年2月又改為需要進行感染實驗，以確認致病因果關系。本研究認為這兩種要求均不具有可操作性。首先，副溶血弧菌廣泛存在于環(huán)境中，將增菌液或組織勻漿液涂布于平板培養(yǎng)后，能挑選到攜帶質(zhì)粒的單菌落的概率很小，而且AHPND肝胰腺增菌混合液在反復增菌后，PCR擴增不出陽性條帶，樣品中的優(yōu)勢菌可能在反復增菌過程中逐漸取代了AHPND致病毒菌，使得毒素基因很難再被檢測到。其次，關于感染實驗，需要使用SPF級別的敏感宿主南美白對蝦或斑節(jié)對蝦，需要具備一定級別的實驗室條件和設備，可操作性低。因此，本研究認為只要獲得了含有攜帶毒素質(zhì)粒的混合菌液，結(jié)合PCR和測序比對，就能確認為AHPND陽性。

Kongrueng等[13]從泰國南部發(fā)現(xiàn)了幾株具有血清學相似性AHPND副溶血弧菌，它們的脈沖場凝膠電泳圖譜密切相似。由此他們推斷，這些菌株可能都起源于一個單一的克隆，但目前仍缺乏說服力。因為這些菌株都來自于單一的地理區(qū)域，缺乏地理多樣性。而在其它報道中[14]，也都是從一個區(qū)域的養(yǎng)殖場樣品中分離出不同的AHPND致病株。PVA1 質(zhì)粒來源于單一的副溶血弧菌菌株，還是來源于不同的菌株，目前還不清楚。若想有效解決這個問題，必須使AHPND致病菌株具有廣泛的地理多樣性。本次檢測可以為國內(nèi)外AHPND病原檢測提供很好的經(jīng)驗，為今后的AHPND的病原檢測提供重要的檢驗依據(jù)。

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（責任編輯：朱迪國）

Analysis on the Test Result of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease from Imported Penaeus vannamei Broodstock

Zhang Na1，Wang Jinjin2，Xie Yanhui1，Yu Li2，Li Jiaqiao1，Liu Ying2
（1. Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang，Guangdong 524000；2. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

Abstract：Acute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND）is an emerging disease causing enormous loss to shrimp aquaculture. The pathogen is a kind of Vibrio parahaemolyticus with plasmid of toxin，but its detailed pathogenic mechanism is still unclear. The primers targeting toxin plasmid were used to detect AHPND from a batch of imported Penaeus vannamei broodstock in this study. The PCR results showed that the same sized band confirmed AHPND was positive. Analysis on the results and processes of performance provided important data for AHPND detection in China.

Key words：AHPND；EMS；toxin plasmid；PCR amplification

中圖分類號：S945.4

文獻標識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）07-0090-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.027

基金項目：國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2010IK007）