張佑民

【摘要】 目的 研究 microRNA-21參與乳腺癌侵襲轉移的調控機制。方法 采用實時定量反轉錄 -聚合酶反應 （RT-PCR）方法檢測MDA-435、MDA-231和 MCF-7乳腺癌細胞株 microRNA-21的表達；采用 transwell方法測定上述三株乳腺癌細胞體外侵襲轉移能力；人工合成 microRNA-21干擾序列 ， 轉染MDA-231、MDA-435乳腺癌細胞 ， 觀察對細胞侵襲能力的影響；應用 Western blot檢測逆轉誘導蛋白（RECK）的表達；采用熒光報告基因實驗檢測 RECK與 microRNA-21的結合情況。結果 MCF-7、MDA-231及 MDA-435細胞株中均具有 microRNA-21高表達 ， 且表達量 MDA-435>MDA-231>MCF-7， 其中 ， 具有高侵襲特性的 MDA-435細胞具有最高水平 microRNA-21的表達為 （4.51±0.71）， MDA-231細胞具有中等水平的 microRNA-21表達為 （2.67±0.27）， MCF-7細胞表達microRNA-21水平相對較低為 （1.23±0.11）， 比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。三株細胞中 ， MDA-435細胞侵襲力最高為（425.4±35.0）細胞數(shù)/視野 ， MCF-7最低為（142.7±13.4）細胞數(shù)/視野 ， MDA-231居中為（263.7±24.4）細胞數(shù)/視野 ， 三組細胞侵襲力比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。將 anti-microRNA-21分別轉染入 MDA-231和 MDA-435細胞 ， 與對照組比較 ， 兩種細胞株轉染 anti-microRNA-21后分別引起 56%和 67%的 microRNA-21表達量降低 ， 比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。將anti-microRNA-21轉染入MDA-231細胞， 與陰性對照組比較 ， anti-microRNA-21引起了 34%細胞侵襲數(shù)目的減少。將 anti-microRNA-21轉染入 MDA-435細胞 ， 結果表明 anti-microRNA-21引起68%侵襲細胞數(shù)目的下降。Western blot檢測顯示 ， microRNA-21表達下調， MDA-435細胞中 RECK表達明顯增強；熒光素酶實驗顯示共轉染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435細胞熒光酶活性增加38%。結論 本研究提示 microRNA-21可促進乳腺癌侵襲轉移 ， 其作用可能與逆向調控 RECK有關。

【關鍵詞】 乳腺癌；侵襲；microRNA-21；伴 Kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白；RNA干擾

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.16.195

【Abstract】 Objective To research regulation mechanism of microRNA-21 for breast cancer invasion and metastasis. Methods Real-time quantification polymerase chain reaction （RT-PCR） was applied to detect miR-21 expression in MDA-435， MDA-231 and MCF-7 breast cancer strains. In vitro invasion and metastasis of these three strains were detected by transwell method. Transfection on MDA-231 and MDA-435 cell was made by synthetic microRNA 21 interference sequence to observe the influence on cell invasion. Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs （RECK） protein expression was detected by Western blot， and combination of RECK and microRNA-21 was detected by luciferase reporter gene test. Results All MCF-7， MDA-231 and MDA-435 strains had high expressed microRNA-21， and their expression volume were shown as MDA-435>MDA-231>MCF-7. MDA-435 with high invasion feature showed the highest microRNA-21 expression level as （4.51±0.71）， followed by microRNA-21 expression in MDA-231 as （2.67±0.27） and in MCF-7 as （1.23±0.11）， and their difference had statistical significance （P<0.01）. Among the three strains， MDA-435 had the highest cell invasion as （425.4±35.0） cell number/vision， MCF-7 had the lowest as （142.7±13.4） cell number/vision， and MDA-231 as （263.7±24.4） cell number/vision. The difference of cell invasion had statistical significance across the three strains （P<0.01）. MDA-231 and MDA-435 cells received transfection of anti-microRNA-21. Comparing with the control group， transfection of anti-microRNA-21 in the two cell strains showed respectively 56% and 67% decreased microRNA-21 expression， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Comparing with the negative control group， MDA-231 with transfection of anti-microRNA-21 showed 34% decreased cell invasion count. MDA-435 with transfection of anti-microRNA-21 showed 68% decreased cell invasion count. Western blot test Detection by Western blot showed down-regulated microRNA-21 expression and enhanced RRECK expression in MDA-435 cell. Luciferase test showed increased fluorescence enzyme activity by 38% in MDA-435 cell with RECK and anti- microRNA-21 transfection. Conclusion This research shows promotion of breast cancer invasion and metastasis by microRNA-21， and its effect may have relationship with reverse regulation of RECK.

【Key words】 Breast cancer； Invasion； microRNA-21； Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs； RNA interference

microRNAs是新近識別的人體內一類內源性非編碼小分子核糖核酸 （RNA）， 通過與靶基因互補結合 ， 在轉錄后水平調控靶蛋白表達 ， 從而參與生物體各項生物學活動。前期研究顯示[1]， microRNA-21在乳腺癌細胞中高表達并與阿霉素耐藥有關 ， 并有研究提示[2]， microRNA-21高表達與乳腺癌患者轉移有關。本研究擬采用 RNA干擾技術降低 microRNA-21的表達 ， 觀察對乳腺癌細胞侵襲轉移的影響 ， 并觀察對其潛在靶基因：伴Kazal域的富含半胱氨酸的 RECK的表達調控。本研究旨在為深入闡述乳腺癌侵襲轉移調控機制提供實驗室依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 細胞株 人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-231和 MDA-435由山東省腫瘤防治研究院基礎研究中心常規(guī)保存。于含10%小牛血清的細胞凍存培養(yǎng)基 （DMEM）中 ， 37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1. 1. 2 主要試劑和儀器 脂質體 Lipofectamine 2000、Trizol試劑、實時定量 RT-PCR試劑盒、matrigel膠購自美國 Invitrogen 公司 ， transwell小室購自美國 Coning公司 ， 蛋白提取試劑盒購自生工生物工程 （上海 ）股份有限公司。RECK和 β-actin抗體購于美國 Santa Cruz公司。定量 PCR儀 ABI7000購于美國 ABI公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 實時定量 RT-PCR檢測microRNA-21的表達 應用Trizol提取細胞RNA。microRNA-21逆轉錄引物為 5GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA3； 上游引物為 5GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG3， 下游引物為 5GTGCAGGGTCCGAGGT3； 應用互補脫氧核糖核酸（cDNA）逆轉錄試劑盒進行逆轉錄 ， 采用定量 PCR試劑盒進行PCR。應用 U6 RNA的表達進行標準化計算?CT值， 重復實驗 3次， 以“均數(shù) ±標準差”表示。

1. 2. 2 細胞轉染 根據(jù) Pubmed數(shù)據(jù)庫中的 microRNA-21基因序列 ， 設計合成 microRNA-21干擾序列為 5-UCAA CAUCAGUCUGA UAAGCUA-3， 對照序列為 5-CAGUACU UUUGUAGUACAA-3， 上述序列由上海吉瑪技術有限公司設計合成。以 Lipofectamine 2000為載體， 轉染MDA-231、MDA-435細胞株。具體步驟為：轉染前 1 h更換為無血清的 DMEM培養(yǎng)液 ， 將 siRNA-脂質體復合物加到含有細胞及培養(yǎng)基的實驗組孔中；陰性對照的細胞中只加入脂質體。細胞同時置 CO 2培養(yǎng)箱 37℃中培養(yǎng) 5 h， 更換培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。

1. 2. 3 細胞侵襲實驗 應用 DMEM按 1∶5 稀釋 Matrigel 基質膠 ， 將 transwell 小室置于 24 孔板中 ， 取 100 ?l稀釋膠加至上室 ， 室溫干燥過夜。siRNA轉染組細胞及未轉染組細胞培養(yǎng) 48 h后 ， 應用無血清的 DMEM調整細胞密度至 3×10 5/ml， 轉至 Matrigel包被的 transwell小室中 （6孔板 ， 8 ?m小孔）。在小室下層加入含 10%血清的 DMEM作為趨化劑。孵育 20 h后 ， 應用棉簽拭去非侵襲性細胞。應用結晶紫固定并染色。在 100倍熒光顯微鏡下計數(shù)細胞。

1. 2. 4 Western Blot檢測 RECK蛋白的表達 MDA-231、MDA-435siRNA轉染組細胞及未轉染組細胞培養(yǎng) 24 h， 應用細胞裂解液[0.15 mol/L NaCl， 0.05 mol/L pH7.5 Tris-Cl， 2 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）， 0.5%Triton-100， 5 mmol/L DTT， 0.2 mmol/L PMSF， 2 mg/L apoptinin]提取細胞總蛋白。取 75 ?g蛋白行 8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ， 以 100 V電轉移 1 h將凝膠上的蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。5%脫脂奶粉封閉 2 h。加入 RECK一抗 （1∶250）、β-actin一抗 （1∶500）室溫孵育 2 h， 加入適當比例稀釋的羊抗鼠或羊抗兔二抗常溫孵育1 h。加 ECL顯色劑于暗室曝光顯像， 行圖像分析。

1. 2. 5 熒光素酶報告基因實驗 擴增包含 RECK 3UTR區(qū)靶位點的引物為上游 5- ATTAACTAGTACCTCTATTCGCCA CACAG-3；下游 5-CTACATCAGCA CTGACATATTCTG -3。經限制性內切酶 （SpeI）切 PCR產物后 ， 將 RECK 3‘UTR克隆入pGL3熒光素酶質粒載體， 轉染入MDA-435細胞株。5 h后， 繼續(xù)轉入 50 nMmicroRNA-21 inhibitor或對照序列。24 h后 ， 裂解細胞檢測熒光素酶活性。pGL3質粒作為共轉染的對照。每次轉染實驗重復 2次。

1. 3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 乳腺癌細胞株 microRNA-21基因表達 應用 Taqman PCR方法檢測 3種乳腺癌細胞株（MCF-7、MDA-231和 MDA-435）microRNA-21的表達。其中， 具有高侵襲特性的 MDA-435細胞具有最高水平 microRNA-21的表達為 （4.51±0.71）， MDA-231細胞具有中等水平的 microRNA-21表達為 （2.67±0.27）， MCF-7細胞表達microRNA-21水平相對較低為 （1.23±0.11）， 比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1。

2. 2 乳腺癌細胞株侵襲轉移能力的測定 采用 transwell方法測定侵入濾膜的細胞數(shù) ， 判定上述三株乳腺癌細胞侵襲轉移能力。結果顯示 ， MDA-435細胞侵襲力最高為 （425.4±35.0）細胞數(shù) /視野 ， MCF-7最低為 （142.7±13.4）細胞數(shù) /視野 ， MDA-231居中為 （263.7±24.4）細胞數(shù) /視野。三組細胞侵襲力比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1。

2. 3 乳腺癌細胞株 microRNA-21基因干擾效果評價 將 anti-microRNA-21分別轉染入 MDA-231和 MDA-435細胞 ， 與對照組比較 ， 兩種細胞株轉染 anti-microRNA-21后分別引起 56%和 67%的 microRNA-21表達量降低 ， 比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。

2. 4 microRNA-21表達改變對乳腺癌細胞株侵襲轉移的影響將anti-microRNA-21轉染入MDA-231細胞， 與陰性對照組比較 ， anti-microRNA-21引起了 34%細胞侵襲數(shù)目的減少。將 anti-microRNA-21轉染入 MDA-435細胞 ， 結果表明 anti-microRNA-21引起68%侵襲細胞數(shù)目的下降。見圖3。

2. 5 microRNA-21對 RECK的表達調控影響 將 anti-microRNA-21分別轉染入 MDA-231細胞和 MDA-435細胞。Western blot 結果顯示 ， MDA-231及 MDA-435細胞無或少許 RECK表達 ， 在 MDA-435細胞中 anti-microRNA-21下調 ， 引起較明顯的 RECK蛋白的表達增加。MDA-231細胞中 RECK的表達亦有增強 ， 但變化不明顯。見圖4。為了進一步證實 RECK mRNA的3UTR區(qū)是 microRNA-21的功能性靶點 ， 進行了熒光素酶實驗 ， 與陰性對照組比較 ， 共轉染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435細胞熒光酶活性增加了38%。見圖5。

3 討論

>50%的人類 miRNA定位于與腫瘤相關的基因組位置， 并且 miRNAs通過調控多個靶基因的表達從而調控多種細胞生物學進程 ， 提示這些分子在腫瘤中具有潛在的重要作用[3-6]。microRNA-21就是這類分子的其中之一。microRNA-21定位于染色體17q23.2， 此位點在一個常見的斷裂位點 FRA17B之內。這一區(qū)域通常在結腸癌、乳腺癌和肺癌中出現(xiàn)擴增 ， 同時也與microRNA-21在多種類型腫瘤中過表達相一致[7-12]。本研究中 ， 發(fā)現(xiàn) microRNA-21在多種乳腺癌細胞中均有高表達 ， 而且細胞內源性 microRNA-21的表達與腫瘤細胞株侵襲轉移能力呈正相關。這些發(fā)現(xiàn)與既往幾個研究相一致 ， 提示 microRNA-21高表達可能與乳腺癌侵襲轉移有關。

RECK基因是一個轉化抑制基因 ， 通過篩查纖維母細胞cDNAs表達文庫被證實 ， 其可將 v-Ki-ras轉化的 NIH3T3細胞的圓形形態(tài)轉變?yōu)榉寝D化的扁平形態(tài)[13-15]。RECK是一個分子量為 110 kPa的膜嵌合糖蛋白， 位于9p13～p12， 長度 >87 kb， 包含多個表皮生長因子樣重復片段和絲氨酸蛋白酶抑制物樣的結構域 ， 在結構上與 TIMPs具有同源性[16-18]。RECKmRNA在人類的各種正常組織和未轉化細胞中廣泛表達 ， 但在癌基因轉化細胞中檢測不到或下調。經 Pubmed數(shù)據(jù)庫比對 ， RECK部分基因序列與 microRNA-21序列互補結合。在最近的研究中[19， 20]， RECK被報道是 microRNA-21的功能性靶基因 ， 并參與膠質瘤、食管癌的侵襲轉移過程。

本文研究結果顯示， MCF-7、MDA-231及 MDA-435細胞株中均具有 microRNA-21高表達 ， 且表達量 MDA-435>MDA-231>MCF-7， 其中 ， 具有高侵襲特性的 MDA-435細胞具有最高水平 microRNA-21的表達為 （4.51±0.71）， MDA-231細胞具有中等水平的 microRNA-21表達為 （2.67± 0.27）， MCF-7細胞表達microRNA-21水平相對較低為 （1.23± 0.11）， 比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。三株細胞中， MDA-435細胞侵襲力最高為 （425.4±35.0）細胞數(shù) /視野 ， MCF-7最低為（142.7±13.4） 細胞數(shù) /視野 ， MDA-231居中為 （263.7± 24.4）細胞數(shù) /視野 ， 三組細胞侵襲力比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。將 anti-microRNA-21分別轉染入 MDA-231和 MDA-435細胞 ， 與對照組比較 ， 兩種細胞株轉染 anti-microRNA-21后分別引起 56%和 67%的 microRNA-21表達量降低 ， 比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。將anti-microRNA-21轉染入MDA-231細胞， 與陰性對照組比較， anti-microRNA-21引起了 34%細胞侵襲數(shù)目的減少。將 anti-microRNA-21轉染入 MDA-435細胞 ， 結果表明 anti-microRNA-21引起68%侵襲細胞數(shù)目的下降。Western blot檢測顯示 ， microRNA-21表達下調 ， MDA-435細胞中 RECK表達明顯增強；熒光素酶實驗顯示共轉染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435細胞熒光酶活性增加38%。microRNA-21高表達與乳腺癌細胞侵襲特性相關 ， 因此假設 RECK在乳腺癌中也是 microRNA-21的一個重要靶點。經 Western blot和熒光素酶實驗顯示 ， microRNA-21表達下調與 RECK蛋白表達呈負相關 ， 在MDA-435細胞中共轉染 RECK 3UTR和 anti-microRNA-21導致了顯著性熒光報告基因活性的增加。這些發(fā)現(xiàn)提示 RECK可能部分受到 microRNA-21的負性調控。

綜上所述 ， microRNA-21在乳腺癌細胞中表達增高并與腫瘤侵襲轉移有關 ， RNA干擾 microRNA-21的表達可以抑制乳腺癌細胞的侵襲。這些作用可能部分通過 microRNA-21靶向調控RECK而產生。

參考文獻

[1] 李強 ， 王興武 ， 宋寶 . microRNA-21對乳腺癌 MCF-7/ADR細胞株多柔比星耐藥性影響的研究 . 中華腫瘤防治雜志 ， 2012， 19（3）：188-191.

[2] Ozgun A， Karagoz B， Bilgi O， et al. MicroRNA-21 as an indicator of aggressive phenotype in breast cancer.Onkologie， 2013， 36（3）：115-118.

[3] Calin GA， Sevignani C， Dumitru CD， et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. ProcNatlAcadSci USA， 2004， 101（9）：2999-3004.

[4] Yin-Hsun F， Chao-Liang W， Chao-Jung T， et al. Deregulated expression of sprouty2 and microRNA-21 in human colon cancer： Correlation with the clinical stage of the disease. Cancer Biology & Therapy， 2011， 11（1）：111-121.

[5] Rabien A， Ergun B， Erbersdobler A， et al. RECK overexpression decreases invasive potential in prostate cancer cells. Prostate， 2012， 72（9）：948-954.

[6] Meng N， Li Y， Zhang H， et al. RECK， a novel matrix metalloproteinase regulator. HistolHistopathol， 2008， 23（8）：1003-1010.

[7] Ciafre SA， Galardi S， Mangiola A， et al. Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma.BiochemBiophys Res Commun， 2005， 334（4）：1351-1358.

[8] Wang N， Zhang CQ， He JH， et al. MiR-21 down-regulation suppresses cell growth， invasion and induces cell apoptosis by targeting FASL， TIMP3， and RECK genes in esophageal carcinoma. Dig Dis Sci， 2013， 58（7）：1863-1870.

[9] 姜濤. 抑制microRNA-21表達降低結腸癌侵襲轉移能力的實驗研究. 天津醫(yī)科大學， 2011.

[10] 劉文新， 李月峰， 朱小蘭， 等. miR-21對乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響. 江蘇醫(yī)藥， 2014， 40（17）：1998-2001.

[11] 田俊梅， 涂真珍， 顧月清. MicroRNA-21表達調控研究. 藥物生物技術， 2012（1）：65-69.

[12] 晁振華. 二甲雙胍對乳腺癌細胞侵襲遷移的影響及miR-625的調控作用. 蚌埠醫(yī)學院， 2014.

[13] 馬海忠. MiR-221/222調控基底樣乳腺癌的發(fā)生和侵襲轉移的研究. 蘭州大學， 2014.

[14] 李秀. miRNA-21在肝細胞癌中的表達及其功能研究. 西北大學， 2012.

[15] 劉振. MicroRNA-21通過誘導上皮間質轉化進程促進膽管癌細胞侵襲與轉移的研究. 安徽醫(yī)科大學， 2014.

[16] 王金淼， 姜濤， 戚峰， 等. 抑制microRNA-21表達降低HCT-116細胞侵襲轉移能力的實驗研究. 天津醫(yī)科大學學報， 2016（1）：13-16.

[17] 廣維， 尹新江， 何春滌. MicroRNA-21在皮膚鱗狀細胞癌中的研究現(xiàn)狀. 中國麻風皮膚病雜志， 2014， 30（2）：87-91.

[18] 吳子晏. MicroRNA-21在骨肉瘤生物學行為作用機制中的研究. 華中科技大學， 2011.

[19] 韓艷慶. 裸鼠人結腸癌種植瘤miRNA--21相關調控基因的實驗研究. 天津醫(yī)科大學， 2012.

[20] 邱芳， 李晶. 抑制miR-21表達對乳腺癌細胞株MDA-MB-231生存和凋亡的影響. 第二軍醫(yī)大學學報， 2011， 32（6）：691-693.

[收稿日期：2016-02-16]