吳江瑞，齊廣才，崔生飛，張咪咪，劉珍葉

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，延安　716000)

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固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定瀉痢消片中4種有效成分

吳江瑞，齊廣才*，崔生飛，張咪咪，劉珍葉

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，延安716000)

摘要：目的建立采用SPE-HPLC法同時(shí)測(cè)定瀉痢消片中芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷含量的方法。方法采用C18固相萃取柱對(duì)瀉痢消片中的有效成分進(jìn)行凈化、富集，用HPLC法測(cè)定含量。色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-5 mL·L-1磷酸溶液，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為230，276和284 nm，柱溫為28 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷分別在0.617 0～30.85(r=1.000 0)，0.159 8～7.944(r=0.999 8)，0.972 8～48.64(r=1.000 0)和0.123 6～6.180 μg·mL-1(r=0.999 9)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率(n=6)分別為99.4%，98.3%，97.8% 和97.7%。RSD值分別為0.97%，1.11%，1.28% 和1.26%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于瀉痢消片中的4種有效成分的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：瀉痢消片；芍藥苷；甘草苷；柚皮苷；橙皮苷；固相萃?。桓咝б合嗌V法

瀉痢消片是由酒黃連、酒白芍、木香、枳殼、陳皮、茯苓、甘草等十二味中藥組方制成的治療腹瀉腹痛的中藥制劑；具有清熱燥濕、行氣鎮(zhèn)痛和化濁止痢的功效；主要用于大腸濕熱所致的腹痛泄瀉、大便不爽、里急后重、膿血便等癥[1-2]。方中酒白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛的作用，甘草的功能主要是補(bǔ)脾益氣、清熱解毒，并輔以枳殼和陳皮起到行滯消脹和理氣健脾的作用[3]，對(duì)于治療腹瀉痢疾具有良好的效果。目前，關(guān)于瀉痢消片中有效成分含量的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道，為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)對(duì)其中芍藥苷[4]、甘草苷[5]、柚皮苷[6]和橙皮苷[7]4種有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，并運(yùn)用固相萃取法(SPE)結(jié)合超聲提取對(duì)樣品進(jìn)行前處理優(yōu)化[8-13]，以期多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)其質(zhì)量，所建立的SPE-HPLC分析方法能夠明顯減少雜質(zhì)干擾，具有快速、簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)瀉痢消片的質(zhì)量控制有重要的指導(dǎo)意義。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀

(含二極

管陣列檢測(cè)器)；電子分析天平(AUY220型)；超聲波清洗器(KQ-250B)；固相萃取裝置(The BAKER spe-12G Glass Column Processor)，Thermo HyperSep C18固相萃取柱(美瑞泰克科技公司)。

1.2試藥芍藥苷(批號(hào)110736-201438)、甘草苷(批號(hào)111610-201106)、柚皮苷(批號(hào)110722-200610)和橙皮苷(批號(hào)110721-201316)4種對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；瀉痢消片(規(guī)格：每片0.35 g；批號(hào)：LMA1304，LMA1309，LEA1409；云南白藥集團(tuán)麗江藥業(yè)有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(美國(guó)DIKMA公司)；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-5 mL·L-1磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～6 min，24% A；6～10 min，24% A→30% A)。流速：1.0 mL·min-1；波長(zhǎng)切換：0～6 min，230 nm；6～7 min，276 nm；7～10 min，283 nm。柱溫：28 ℃，進(jìn)樣量：20 μL，峰面積外標(biāo)法定量。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1瀉痢消片HPLC圖譜

A.對(duì)照品；B.樣品；C.缺白芍陰性樣品；D.缺甘草陰性對(duì)照；E.缺枳殼陰性對(duì)照；F.缺陳皮陰性對(duì)照；1．芍藥苷；2．甘草苷；3．柚皮苷；4．橙皮苷

Fig.1 HPLC chromatograms of Xielixiao Tablets

A.reference substances；B.sample；C.negative sample without RadixPaeoniaeAlba； D.negative sample withoutLicorice；E.negative sample withoutFructusAurantii；F.negative sample withoutCitrus；1.paeoniflorin； 2.liquiritin；3.naringin； 4.hesperidin

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取對(duì)照品芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷適量，分別置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為192.8，198.6，152.0和308.8 μg·mL-1的單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0 mL、甘草苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL、柚皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液8.0 mL和橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ(芍藥苷30.85 μg·mL-1，甘草苷7.944 μg·mL-1，柚皮苷48.64 μg·mL-1，橙皮苷6.180 μg·mL-1)。

2.2.2供試品溶液的制備取瀉痢消片適量，除去包衣，置于研缽，研細(xì)混勻，取其粉末約1.0 g，精密稱定，置于100 mL具塞三角瓶中，精密加甲醇25.00 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，精密量取所得續(xù)濾液10 mL上樣至預(yù)先用甲醇(5 mL×2)活化，水(5 mL×2)平衡的固相萃取柱中，然后用5 mL體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇淋洗樣品，以小于2 mL·min-1的流速淋洗，棄去全部流出液；用5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇洗脫，收集洗脫液至10 mL量瓶中。

2.2.3陰性樣品溶液的制備按照處方比例及制備工藝，取處方中除白芍、甘草、枳殼和陳皮外的其他藥味，制得陰性對(duì)照樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ0.50，1.00，3.00，5.00，10.00和25.00 mL，分別置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度對(duì)照品混合溶液。分別精密吸取上述系列對(duì)照品混合溶液各20 μL注入色譜儀，以色譜峰面積Y對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度X(μg·L-1)進(jìn)行線性擬合。求得芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷回歸方程分別為：Y1=15.626X1-0.891 2(r1=1.000 0)，Y2=18.185X2+5.325 2(r2=0.999 8)，Y3=16.057X3+0.239 2(r3=1.000 0)，Y4=17.492X4+2.096 8(r4=0.999 9)。結(jié)果表明，芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷分別在0.617 0～30.85，0.159 8～7.944，0.972 8～48.64和0.123 6～6.180μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)按照2.1項(xiàng)下色譜條件，精密吸取對(duì)照品混合儲(chǔ)備液Ⅰ20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷等峰面積的RSD值分別為0.61%，0.86%，1.08%和2.34%。儀器精密度符合要求。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，取同一批號(hào)(批號(hào)LMA1304)樣品，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣20μL，測(cè)得峰面積，結(jié)果芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷的RSD分別為1.31%，2.68%，0.92%和2.61%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液20μL，按照上述色譜條件，分別在0，2，4，6，8和10h進(jìn)樣，測(cè)得芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷峰面積的RSD值分別為0.82%，1.27%，0.32% 和1.18%。結(jié)果表明，供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)LMA1304)6份，每份約0.5g，分別精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為192.8μg·mL-1)1.0mL，甘草苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為198.6μg·mL-1)0.2 mL，柚皮苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為152.0 μg·mL-1)3.0 mL，橙皮苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為308.8 μg·mL-1)0.1 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4樣品含量測(cè)定取3批樣品，每批樣品取5份，按照2.2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3討論

3.1提取方法的選擇(1)實(shí)驗(yàn)用水、甲醇、乙醇和乙腈4種不同溶劑提取樣品，結(jié)果表明，用甲醇對(duì)樣品進(jìn)行提取優(yōu)于其他3種溶劑，且與雜質(zhì)能夠有效分離。(2)采用超聲法、固相萃取法、超聲法結(jié)合固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行處理，比較各方法可知，超聲法提取后樣品中的雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重；直接用固相萃取法不能將樣品完全提?。怀曁崛『?，再進(jìn)行固相萃取雜質(zhì)干擾少，對(duì)樣品成分的提取效率高，故選用此法。(3)比較超聲處理時(shí)間10，20，40，60，80和100 min，發(fā)現(xiàn)超聲20 min即能將被測(cè)成分提取完全。(4)比較用甲醇溶液5，15，25，40，50和60 mL提取樣品，結(jié)果用25 mL甲醇溶液提取的含量最高。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery tests

(n=6)

表2樣品含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Determination results of samples

(n=5)

3.2固相萃取條件的優(yōu)化

3.2.1固相萃取柱的選擇實(shí)驗(yàn)中比較了Thermo HyperSep C18固相萃取柱和Thermo Hy- perSep Retain PEP固相萃取小柱的萃取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者對(duì)芍藥苷和橙皮苷的提取相差甚小，而C18固相萃取柱對(duì)甘草苷和柚皮苷的提取優(yōu)于PEP固相萃取小柱，且分離徹底，故選用Thermo HyperSep C18固相萃取柱。

3.2.2淋洗溶劑的優(yōu)化分別取樣品0.5，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL對(duì)上樣體積進(jìn)行考察，由于樣品中雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重，當(dāng)上樣體積大于8.0 mL時(shí)，顯示出較好的抗干擾效果，為保證回收率，上樣體積選取10.0 mL。用水，體積分?jǐn)?shù)分別為1%，3%，5%，8%和10%的甲醇為淋洗溶劑，收集淋洗液，用HPLC檢測(cè)，結(jié)果顯示,用體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇淋洗時(shí)任何目標(biāo)物不被洗脫，為了減少雜質(zhì)的干擾并得到最佳的提取效果，確定用體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇淋洗溶液。

3.2.3洗脫條件的優(yōu)化選擇不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇(5%，25%，45%，65%，80% 和100%)溶液進(jìn)行洗脫，用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇洗脫，雜質(zhì)干擾少，提取率也較高。選取洗脫體積(1，3，5，7，9和10 mL)時(shí)，用5和7 mL結(jié)果并無(wú)差異，為了洗脫完全又不浪費(fèi)溶劑，最終選取5 mL進(jìn)行洗脫。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇樣品中4種苷類(lèi)物質(zhì)的色譜峰經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，其UV光譜與各自對(duì)照品的UV光譜一致，芍藥苷在230 nm處有最大吸收峰，甘草苷在276 nm處有最大吸收峰，柚皮苷和橙皮苷均在283 nm處有最大吸收峰，因此均選用各自最大吸收峰處的波長(zhǎng)作為實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)。

3.4流動(dòng)相的選擇比較流動(dòng)相(A)甲醇-水，(B)乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液，(C)乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液，結(jié)果顯示，3種流動(dòng)相均可達(dá)到分離效果，但是用流動(dòng)相(A)雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重，而在流動(dòng)相中加入磷酸(B、C)抑制苷中酚羥基的離解，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。(C)比(B)使柚皮苷和橙皮苷的峰形更好，最終選取(C)作為實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

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基金項(xiàng)目：延安大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：吳江瑞，女，碩士研究生

*通信作者：齊廣才，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.016

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0379-05

(收稿日期：2015-09-15)

Determination of 4 kinds of effective components in Xielixiao Tablets by SPE-HPLC

WU Jiangrui，QI Guangcai*，CUI Shengfei，ZHANG Mimi，LIU Zhenye

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Yan′an University，Yan′an 716000，China)

Abstract:Objective To establish a solid-phase extraction with high-performance liquid chromatography(SPE-HPLC) method for the determination of paeoniflorin，liquiritin，naringin，and hesperidin in Xielixiao Tablets．Methods Using C18solid phase extraction column,the active ingredients of Xielixiao Tablets were purified and enriched．The contents were analyzed by HPLC method with Kromasil C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)．The mobile phase was composed of acetonitrile and 5 mL·L-1phosphoric acid in gradient elution．Detection wavelength was set at 230，276 and 284 nm．The column temperature was maintained at 28 ℃，and injection volume was 20 μL．The flow rate was 1.0 mL·min-1．Results The calibration curves of paeoniflorin，liquiritin，naringin，and hesperidin showed good linearity within 0.617 0-30.85(r=1.000 0)，0.159 8-7.944(r=0.999 8)，0.972 8-48.64(r=1.000 0)，and 0.123 6-6.180 μg·mL-1(r=0.999 9),respectively．The average recoveries were 99.4%，98.3%，97.8% and 97.7%．RSDs were 0.97%，1.11%，1.28% and 1.26%，respectively．Conclusion The method is simple,fast，sensitive，and accurate，and can be used for the quality control of 4 kinds of effective components in Xielixiao Tablets．

Key words：Xielixiao Tablets；paeoniflorin；liquiritin；naringin；hesperidin；SPE；HPLC