張偉，李翠萍，楊志軍，何廣杰

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；b.法醫(yī)系，河南 新鄉(xiāng)453003）

紅鰭東方鲀FoxO1基因的原核表達(dá)及純化

張偉a，李翠萍a，楊志軍a，何廣杰b*

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；b.法醫(yī)系，河南 新鄉(xiāng)453003）

摘 要：采集紅鰭東方鲀脂肪組織提取其總RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增和克隆紅鰭東方鲀FoxO1基因的ORF，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET-32/FoxO1，在大腸桿菌Rosetta （DE3）進(jìn)行表達(dá)，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對重組FoxO1蛋白進(jìn)行可溶性分析、純化及鑒定，結(jié)果表明：重組質(zhì)粒pET32a/FoxO1被成功構(gòu)建；用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能與抗His標(biāo)簽的兔多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；純化出了融合表達(dá)蛋白，獲得了相對分子質(zhì)量約為110 000的重組蛋白。

關(guān) 鍵 詞：紅鰭東方鲀；FoxO1基因；原核表達(dá)；蛋白純化

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cn

目前，無論在人類醫(yī)學(xué)還是在農(nóng)業(yè)動(dòng)物生物學(xué)領(lǐng)域，關(guān)于脂肪組織發(fā)育及其調(diào)控的研究均備受矚目。魚肉的品質(zhì)及脂肪沉積調(diào)控成了水產(chǎn)學(xué)科研究中的重要內(nèi)容。脂肪代謝在分子水平上是受關(guān)鍵基因和酶調(diào)控的。Forkhead轉(zhuǎn)錄因子來源于果蠅的“叉頭”突變，又稱為Fox基因。該基因在酵母和真核細(xì)胞生物中廣泛存在。Fox基因含有17個(gè)亞家族，其中對FoxO家族的研究最為深入［1］。哺乳動(dòng)物中FoxO家族中有 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分別為 FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6［2］。FoxO1是FoxO亞家族中的主要成員之一，可能通過多條通路來調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化［3-4］、凋亡［5］、細(xì)胞周期［6］、葡萄糖代謝［7］以及脂肪代謝［8-9］等。FoxO1是胰島素/胰島素樣生長因子信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)下游的靶基因來調(diào)節(jié)脂肪代謝等［10］。FoxO1基因能夠抑制前體脂肪細(xì)胞的增值分化，從而使脂肪的形成減少［11］。FoxO1能夠抑制PPARγ功能復(fù)合體與DNA的結(jié)合［12］。Fajas等［13］發(fā)現(xiàn)FoxO1可能通過抑制PPARγ、p21及p27等的下游靶基因表達(dá)來減少脂肪生成。FoxO1也可以通過抑制MyoD來阻礙

1 材料與方法

1.1 材料

采用紅鰭東方鲀作為試驗(yàn)樣本。取紅鰭東方鲀的脂肪組織，用滅菌DEPC處理水沖洗組織樣，在液氮速凍1 h后取出，置于－80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 紅鰭東方鲀FoxO1基因的鑒定

本試驗(yàn)以斑馬魚 FoxO1的氨基酸序列（NP_001070725.2）為探針，對紅鰭東方鲀基因組數(shù)據(jù)庫（http：//genome.jgi-psf.org/Takru4/Takru4.home. html）進(jìn)行 BLAST分析，以獲得新的紅鰭東方鲀FoxO1 cDNA序列。

1.2.2 FoxO1基因的克隆

利用Trizol試劑（Invitrogen，美國）抽取脂肪組織總RNA。以總RNA為模板，利用SuperScript Ⅲreverse transcriptase（Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，美國）合成cDNA第一鏈。根據(jù)預(yù)測的FoxO1基因序列，在ORF區(qū)兩端設(shè)計(jì)引物（上游引物為5'-ATGGCGGAAGCAGCCCA-3'；下游引物為5'-CCCTG ACACCCAGCTGTGC-3'）。RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用T-A克隆將PCR產(chǎn)物于pGEM T-easy載體（Promega，USA）進(jìn)行相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上初步篩選陽性克隆。菌落PCR鑒定陽性克隆，選擇3個(gè)陽性克隆送Invitrogen（上海）公司進(jìn)行測序。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)克隆得到的紅鰭東方鲀cDNA FoxO1的ORF序列設(shè)計(jì)特異引物（上游引物P1為5′-CGGAA TTCEcoRⅠATGGCGGAAGCAGCCCA-3′；下游引物P2為5′-CCGCTCGAGXhoⅠCCCTGACACCCAGCT GTGC-3′），引物對的劃線部分分別為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA模版1.0 μL，10 μmol/L P1 1.0 μL，10 μmol/L P2 1.0 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 2.0 μL，ddH2O 17.0 μL，1 U/μL KOD- Plus-Neo高保真DNA聚合酶 0.5 μL，總計(jì)25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，61 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體pGEM T-easy （Promaga公司）連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提。將得到的FoxO1基因克隆質(zhì)粒與pET32a質(zhì)粒同時(shí)用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切3 h，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段和載體，并利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109。隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定，并對陽性克隆進(jìn)行增菌培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，送Invitrogen（上海）公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET32a/FoxO1的誘導(dǎo)表達(dá)

對經(jīng)pET32a/FoxO1測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta（DE3）大腸桿菌中，在平板上隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性克隆的接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)后，按1∶50轉(zhuǎn)接到20 mL同樣的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD值為0.8，取出5 mL菌液作為未誘導(dǎo)對照，其他加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)5 h后離心，收集菌體，裝菌體放入冰上，利用超聲波進(jìn)行破碎，10 000 ×g 4 ℃離心20 min后將上清液轉(zhuǎn)到新離心管，把PBS緩沖液加到沉淀組分中充分懸浮振蕩。將樣品加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后煮沸裂解5 min。利用SDS-PAGE電泳技術(shù)檢測目的蛋白的表達(dá)。

1.2.5 目的蛋白的純化與Western Blot檢測

使用鎳柱純化上清部分，先上低鹽緩沖液平衡柱材，再用上清液上柱，重懸柱材，冰浴30 min，棄去流出液，用15倍柱體積低鹽緩沖液洗脫，10倍柱體積高鹽緩沖液洗脫，5倍柱體積低鹽緩沖液洗脫，2倍柱體積洗脫液洗脫，收集樣品液，純化結(jié)果用SDS-PAGE檢測。

從SDS-PAGE膠上切下需要轉(zhuǎn)膜的部分，用純水進(jìn)行沖洗。將濾紙剪成與膠大小相當(dāng)，共剪6張，同時(shí)也將PVDF膜剪成和膠大小相當(dāng)。在轉(zhuǎn)移緩沖液中把PVDF膜與濾紙浸沒平衡10 min。按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序從負(fù)極到正極擺放，連接電源。將凝膠面積按0.8 mA/cm2接通電流，電轉(zhuǎn)移1.5 h后將電源關(guān)掉，將PVDF取出后放進(jìn)塑料袋，加封閉液和1∶1 000稀釋的Anti-His Antibody（GE Healthcare 公司），封口。37 ℃搖床中溫育1 h后取出PVDF膜，先用純水沖洗，再用TBST漂洗3次，每次10 min。將PVDF膜放入內(nèi)加封閉液和經(jīng)1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠酶標(biāo)二抗塑料袋進(jìn)行封閉，搖床中37 ℃溫育1 h后取出PVDF膜，用PBS漂洗3次，ECL顯色，暗室曝光，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET32a/FoxO1重組表達(dá)載體的構(gòu)建

紅鰭東方鲀脂肪組織中提取的總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，可獲得約2 049 bp的條帶，條帶符合預(yù)期大小。測序結(jié)果顯示，此序列全長2 049 bp。圖1中1條為載體，1條為目的條帶。測序結(jié)果表明，所測序列沒有堿基缺失及變異，可初步確認(rèn)所構(gòu)建的pET32a/FoxO1重組表達(dá)質(zhì)粒是成功的，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 重組質(zhì)粒pET32a/FoxO1的酶切分析結(jié)果Fig.1 Restriction analysis on recombinant plasmid of pET32a/FoxO1

2.2 pET–32a/FoxO1重組表達(dá)與純化的融合蛋白

將pET-32a/FoxO1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta （DE3），與誘導(dǎo)前相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳圖譜中增加了大小約110 000的蛋白條帶，其相對分子質(zhì)量與推測融合蛋白的相當(dāng)，而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pET32a的陰性對照在誘導(dǎo)前后均未見相應(yīng)的蛋白條帶（圖2）。表達(dá)的目的蛋白主要以可溶蛋白形式存在，在沉淀中含有部分目的蛋白。試驗(yàn)結(jié)果可初步證實(shí)FoxO1已在大腸桿菌中獲得成功表達(dá)。該試驗(yàn)3次重復(fù)試驗(yàn)的SDS-PAGE電泳結(jié)果基本一致。

圖2 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS–PAGE分析結(jié)果Fig.2 SDS–PAGE analysis on expression products of FoxO1 in Rosetta (DE3)

2.3 Western Blot分析結(jié)果

由圖3可知，經(jīng)pET32a/FoxO1重組質(zhì)粒誘導(dǎo)及純化后，檢測到1條相對分子質(zhì)量約110 000的蛋白條帶，這進(jìn)一步證實(shí)純化蛋白為含6-His標(biāo)簽的紅鰭東方鲀FoxO1融合蛋白。

圖3 目的蛋白的Western Blot檢測結(jié)果Fig.3 Identification results via Western Blot on FoxO1

3 結(jié)論與討論

FoxO1是參與哺乳動(dòng)物脂肪代謝過程的重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與脂肪細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。目前已發(fā)現(xiàn)FoxO1存在于哺乳類、鳥類、爬行類和魚類等多種脊椎動(dòng)物中，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)魚類 FoxO1序列與陸上動(dòng)物既具有相似的保守結(jié)構(gòu)特征，也具有不同的結(jié)構(gòu)特征，提示 FoxO1在魚類和陸上動(dòng)物的脂肪代謝中可能發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。在大腸桿菌表達(dá)菌株中表達(dá)外源重組蛋白是目前應(yīng)用較多的研究方法，其遺傳背景研究較為清楚，因此，應(yīng)用較為廣泛。目前常用的蛋白質(zhì)標(biāo)簽有 GST-tag、His-tag、HSV-tag 及Flag-tag等。因?yàn)閜ET系統(tǒng)所帶標(biāo)簽小，純化方便，不影響蛋白質(zhì)的活性，pET-32a（+）表達(dá)載體的N端含有編碼6個(gè)組氨酸標(biāo)簽（6×His-Tag）的序列，所以，用其進(jìn)行重組蛋白鑒定和純化較為方便［16-17］。成功獲得重組蛋白原核表達(dá)的關(guān)鍵因素有表達(dá)菌株基因型、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑濃度等。IPTG為本研究中所選用的誘導(dǎo)劑，其濃度過低會(huì)因?yàn)榇碳げ粔蚨怪亟M蛋白的表達(dá)量不足；濃度過高會(huì)因?yàn)槎拘暂^大而導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量減少。誘導(dǎo)溫度的高低及時(shí)間的長短主要決定細(xì)菌的生長速率，從而影響蛋白質(zhì)的外源表達(dá)。外源重組蛋白質(zhì)的原核表達(dá)一般選擇在合適溫度進(jìn)行5 h左右的誘導(dǎo)。

為了在體外進(jìn)一步研究紅鰭東方鲀 FoxO1基因的功能，將紅鰭東方鲀FoxO1基因克隆到原核表達(dá)載體 pET-32a，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/FoxO1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 Rosetta（DE3）大腸桿菌中，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，菌液上清液中的表達(dá)量較多。將上清液過鎳柱進(jìn)行純化，用鹽溶液進(jìn)行洗脫，利用SDS-PAGE電泳和Western Blot技術(shù)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)純化后蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量約為110 000，表明所得到蛋白為帶6個(gè)His 的FoxO1融合蛋白質(zhì)。pET-32a/FoxO1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及FoxO1融合蛋白的成功表達(dá)，可為抗體制備及FoxO1蛋白功能的深入研究，尤其為魚類脂肪代謝作用的研究提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 陳小玲，黃志清，毛湘冰，等．FoxO1的功能研究進(jìn)展［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（9）：90-93．

［2］ 朱允和，周海寧，楊波，等．FoxO1基因研究進(jìn)展［J］．中華實(shí)用診斷與治療雜志，2014，28（5）：423-425．

［3］ Bois P R，Grosveld G C．FKHR （FoxO1a） is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts ［J］．EMBO J，2003，22 （5）：1147-1157．

［4］ Armoni M，Harel C，Karni S，et al．Foxo1 represses peroxisome proliferator-activated receptor-gamma1 and -gamma2 gene promoters in primary adipocytes：a novel paradigm to increase insulin sensitivity［J］．J Biol Chem， 2006，281（29）：19881-19891．

［5］ Shen M，Lin F，Zhang J，et al．Involvement of the up-regulated FoxO1 expression in follicular granulosa cell apoptosis induced by oxidative stress［J］．J Biol Chem， 2012，287（31）：25727-25740．

［6］ Yuan C，Wang L，Zhou L，et al．The function of Foxo1 in the late phases of the cell cycle is suppressed by PLK1-mediated phosphorylation ［J］．Cell Cycle，2014，13（5）：807-819．

［7］ Shin D J，Joshi P，Hong S H．Genome-wide analysis of FoxO1 binding in hepatic chromatin：potential involvement of FoxO1 in linking retinoid signaling to hepatic gluconeogenesis ［J］．Nucleic Acids Res，2012，40（22）：11499-11509．

［8］ Bastie C C，Nahle Z，McLoughlin T，et al．FoxO1 stimulates fatty acid uptake and oxidation in muscle cells through CD36-dependent and independent mechanisms ［J］．J Biol Chem，2005，280（14）：14222-14229．

［9］ Zhang W W，Sandip P，Balwant C，et al．FoxO1 regulates multiple metabolic pathways in the liver ［J］．J Biol Chem．2006，281（15）：10105-10117．

［10］ Xu J，Liao K．Protein kinase B/AKT 1 plays a pivotal role in insulin-like growth factor-1 receptor signaling induced 3T3-L1 adipocyte differentiation［J］．J Biol Chem，2004，279（34）：35914-35922．

［11］ Nakae J，Kitamura T，Kitamura Y，et al．The forkhead transcription factor FoxO1 regulates adipocyte differentiation ［J］．Dev Cell，2003，4（1）：119-129．［12］ Dowell P，Otto T C，Adi S，et al．Convergence of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and Foxo1 signaling pathways［J］．J Biol Chem，2003，278（46）：45485-45491．

［13］ Fajas L，Landsberg R L，Huss-Garcia Y，et al．E2Fs regulate adipocyte differentiation［J］．Developmental Cell，2002，3（1）：39-49．

［14］ Allen D L，Unterman T G．Regulation of myostatin expression and myoblast differentiation by FoxO and SMAD transcription factors［J］．Ajp Cell Physiology，2007，292（5）：S62-S63．

［15］ Mcfarlane C， Plummer E，Thomas M，et al. Myostatin induces cachexia by activating the ubiquitin proteolytic system through an NF-kappaB-independent，F(xiàn)oxO1-dependent mechanism［J］．Journal of Cellular Physiology，2006，209（2）：501-514．

［16］ Ribas A V，Ho P L，Tanizaki M M，et al．High-level expression of tetanus toxin fragment C-thioredoxin fusion protein in Escherichia coli ［J］．Biotechnology and Applied Biochemistry，2000，31（2）：91-94．

［17］ Zhao J H，Xu Z，Hua Z C．Expression of human cardiac-specific homeobox protein in Escherichia coli ［J］. Protein Expression and Purification，2000，18（3）：316-319．

責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

中圖分類號(hào)：S917；Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-1032（2016）01-0081-04

收稿日期：2015-05-13 修回日期：2015-12-25

基金項(xiàng)目：河南省科學(xué)技術(shù)廳科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（122102310196）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（12A150019）

作者簡介：張偉（1977—），男，河南長垣人，博士，主要從事基因調(diào)控機(jī)制研究，zhangwei0920@163.com；*通信作者，何廣杰，副教授，博士，主要從事化學(xué)生物學(xué)研究，guangjiehe@163.com骨骼肌的分化［14-15］。目前，關(guān)于魚類FoxO1基因的研究尚少。紅鰭東方鲀是一種模式生物，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，也是中國沿海地區(qū)養(yǎng)殖的主要魚種之一。本研究中以紅鰭東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，研究其FoxO1基因的原核表達(dá)及純化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

Prokaryotic expression and purification of FoxO1 gene from torafugu Takifugu rubripes

Zhang Weia，Li Cuipinga，Yang Zhijuna，He Guangjieb*
（a.School of Basic Medical Science； b.Department of Forensic Medicine， Xinxiang Medical University， Xinxiang，Henan 453003， China）

Abstract：The ORF of FoxO1 gene was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） from total RNA extracted from adipose tissues of torafugu Takifugu rubripes. PET-32a/Sirt1，the prokaryotic expression vector，was constructed and transformed into Escherichia coli Rosetta （DE3） for FoxO1 expression. Through IPTG inducting expression，the induced fusion protein was purified and verified by SDS-PAGE and Western Blot. As a result，the full-length open reading frame of torafugu FoxO1 cDNA was successfully cloned，and the recombinant vector was constructed. The expressed fusion proteins induced by IPTG were soluble protein. The fusion proteins with tag His were also purified，and the molecular weight of the recombinant protein was about 110 000.

Keywords：Takifugu rubripes； FoxO1 gene； prokaryotic expression； protein purification