潘翔　全晶　金露　桂耀庭　楊尚琪　毛向明　來永慶

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·實驗研究·

miR-195-3p在腎癌中的表達及其臨床意義研究

潘翔全晶金露桂耀庭楊尚琪毛向明來永慶

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)(潘翔、全晶、金露)；北京大學(xué)深圳醫(yī)院男性生殖實驗室(桂耀庭)；北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科(楊尚琪、毛向明、來永慶)

【摘要】目的研究miR-195-3p在腎癌與癌旁組織及腎癌細胞與正常細胞系中的表達差異，分析差異表達與患者臨床病理特征間的關(guān)系，探究其臨床意義。 方法提取27例配對標(biāo)本(組織及細胞系)的總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測標(biāo)本中miR-195-3p標(biāo)本中的表達量，統(tǒng)計分析miR-195-3p在不同組織、細胞系間的表達差異及其與臨床病理特征間的相關(guān)性。通過轉(zhuǎn)染上調(diào)和下調(diào)miR-195-3p，并進行細胞增殖實驗(MTT)，評估m(xù)iR-195-3p對腎癌細胞增殖的影響。結(jié)果miR-195-3p在腎癌組織(18例，66.67%)及腎癌細胞系中的表達較癌旁組織及正常細胞系明顯上調(diào)(P<0.05)，miR-195-3p在腎癌中的表達量與患者的年齡、性別、癌組織類型、TNM分期、AJCC分期無明顯相關(guān)性(P>0.05)。miR-195-3p在腎癌細胞系(ACHN、786-O)表達上調(diào)后促進腎癌細胞增殖，表達下調(diào)后抑制腎癌細胞增殖。結(jié)論miR-195-3p在腎癌組織中明顯升高，并且促進腎癌細胞增殖，提示其可能與腎癌的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】腎癌；miR-195-3p

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是腎臟惡性腫瘤中最為常見的一種，世界范圍內(nèi)，RCC是排名第14位的常見惡性腫瘤，其在北美和歐洲的發(fā)病率和死亡率遠高于發(fā)展中國家，且發(fā)展中國家的發(fā)病率仍在不斷上升[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)早期RCC的5年存活率顯著高于晚期，因此早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對腎癌的治療有著至關(guān)重要的作用[3]。但是，目前腎癌的發(fā)生、發(fā)展機制尚不明確，臨床也未曾應(yīng)用一些生物標(biāo)志物對腎癌進行診斷、治療或評估其預(yù)后，腎癌的早期發(fā)現(xiàn)十分困難。因此，以腎癌的發(fā)生機制為基礎(chǔ)去尋找可用于腎癌早期診斷或者靶向治療或判斷其預(yù)后的生物標(biāo)志物是有必要的[4]。

miRNA是一種短鏈非編碼RNA，只有大約22個核苷酸。miRNA能夠非特異性地結(jié)合mRNA上的靶基因, 通過降解或抑制其轉(zhuǎn)錄來調(diào)控基因的表達[5]。miRNA在多種生物進程的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[6]。它不但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，而且在腫瘤的治療上也起著十分重要的作用，miRNA或?qū)⒊蔀橐环N治療腫瘤的潛在的藥物[7]。研究表明，miR-195在某些類型的腫瘤中起抑制作用，在癌細胞過度表達之后，miR-195 能夠抑制細胞周期進程和腫瘤細胞的入侵[8-9]。miR-195有兩個成熟序列，分別是miR-195-5p和miR-195-3p。miR-195-3p位于17號染色體p13.1，且與其他miRNA(如miR-497)形成集群組成miR-15家族[10]。在前期測序的基礎(chǔ)上，本研究對腎癌及其癌旁組織中有表達差異的miR-195-3p進行了qRT-PCR驗證比較，分析miR-195-3p的表達量與患者臨床病理特征間的關(guān)系，以期為miR-195-3p在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制以及對腎癌的診斷價值等后續(xù)臨床研究奠定良好的基礎(chǔ)。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

采集27例RCC和配對癌旁正常組織(取自可見RCC 病灶外約2.0 cm 處)標(biāo)本，RCC組織均由北京大學(xué)深圳醫(yī)院病理科確診，癌旁正常組織均由該病理科經(jīng)顯微鏡確認不含腎癌組織。本研究經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會審查并批準(zhǔn)，參與研究的患者均已簽署知情同意書。臨床分期采用2009年國際抗癌組織(UICC)/美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)分類采用WHO 2004年RCC病理分類標(biāo)準(zhǔn)。研究中所有標(biāo)本供者均具有完整的臨床病理資料。見表1。

表1　miR-195-3p表達水平與臨床病理特征間的關(guān)系

二、細胞培養(yǎng)

人胚腎細胞系：HEK-293T。人腎癌組織細胞系：ACHN、786-O、769P。細胞于含有DMEM(含10%胎牛血清、1%抗生素、1%谷氨酰胺)的培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

三、總RNA 的提取

Trizol試劑提取液氮下碾磨后標(biāo)本中的總RNA，測定總RNA 濃度(使用NanoDrop2000c紫外分光光度計，Thermo Scientific，USA)。

四、總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA

在反應(yīng)體系中加入1 μg 總RNA，在普通PCR 儀(BIO-RAD，USA)上進行逆轉(zhuǎn)錄。使用microRNA專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen，Germany)，反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。

五、qRT-PCR 檢測miR-195-3p的表達量

miR-195-3p上游引物為：5’-CCAATATTGGCTGTGCTGCTCC-3’，下游引物為Qiagen 公司提供的通用引物。內(nèi)參基因采用U6 snRNA，其上游引物為:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)體系:模板cDNA l μl，miR-195上游引物1 μl, 10*miScript通用引物2 μl, 2*Quanti TectS YBR Green PCR Master Mix 10 μl，加無酶水至總反應(yīng)體積20 μl。使用儀器：LC480 熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems，USA)。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共計40個循環(huán)。

六、細胞轉(zhuǎn)染

使用lip2000對miR-195-3p的mimic，inhibitor進行轉(zhuǎn)染，對照為mimic NC(negative control)和inhibitor NC。miR-195-3p mimic正義鏈：5’-CCAAUAUUGGCUGUGCUGCUCC-3’，反義鏈：5’-AGCAGCACAGCCAAUAUUGGUU-3’。Mimic NC 正義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。miR-195-3p inhibitor 序列：5’-GGAGCAGCACAGCCAAUAUUGG-3’。Inhibitor NC序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

七、細胞增殖實驗(MTT)

使用MTT檢測細胞增殖水平，鋪96孔板中，使每孔細胞大約為3 000個，約24 h后進行轉(zhuǎn)染，在0、24、48、72 h加入20 μl MTT在37 ℃溫箱孵育4 h 后，換成150 μl DMSO, 在酶標(biāo)儀(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)上檢測OD值。

八、統(tǒng)計學(xué)方法

腎癌及其癌旁組織中miR-195-3p表達水平采用配對t檢驗進行比較，miR-195-3p表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗或Fisher確切概率分析，取P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計軟件為SPSS 23.0。標(biāo)準(zhǔn)化處理將U6作為內(nèi)參，在qRT-PCR中所得數(shù)據(jù)使用ΔΔCT 法進行分析：ΔCT= CT正常/癌組織-CTU6，ΔΔCT=ΔCT癌組織-ΔCT正常。通過計算2-ΔΔCT得到癌組織中miR-195-3p相對于其配對的癌旁組織中表達量的倍數(shù)。計算OD值，分析經(jīng)過轉(zhuǎn)染后腎癌細胞增殖水平變化。

結(jié)果

一、miR-195-3p在腎癌及其癌旁組織的表達量

通過2-ΔΔCT計算miR-195-3p在腎癌組織中相對癌旁組織的表達倍數(shù)并作圖，發(fā)現(xiàn) miR-195-3p在腎癌組織中的表達量明顯高于其癌旁組織(P<0.05)。見圖1。計算2-ΔΔCT可得到miR-195-3p在腎癌組織中相對其癌旁組織中表達量的倍數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，其大小為4.344±0.482，最小值為0.002 5，最大值為556.4。miR-195-3p在腎癌及其相應(yīng)的癌旁組織中的相對表達量比值經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換后，表達上調(diào)的例數(shù)為18例(66.67%)，表達下調(diào)的為9例(33.33%)。見圖2。

二、miR-195-3p表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性

以腎癌組織中miR-195-3p的相對表達量的平均值4.344為界，經(jīng)四格表χ2檢驗分析，將所研究的病例分為高表達組、低表達組，其中低表達15例，高表達12例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌組織中miR-195-3p表達水平與患者年齡、腎癌組織類型、性別、AJCC 臨床分期、TNM 分期無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

三、miR-195-3p在不同腎癌細胞系與正常細胞系中的表達水平

miR-195-3p在腎癌細胞系相對于正常細胞系的表達量為：ACHN 3.24±0.94；786-O 32.33±10.71；769P 3.88±0.57；293T 1.00±0.13。miR-195-3p在腎癌細胞系中的表達明顯高于正常細胞系，以786-O細胞系最為顯著。見圖3。

四、轉(zhuǎn)染效率驗證

經(jīng)qRT-PCR驗證，轉(zhuǎn)染miR-195-3p mimic后 miR-195-3p的表達水平在ACHN細胞系中提高328.37倍，在786-O細胞系中提高424.58倍。轉(zhuǎn)染miR-195-3p inhibitor后miR-195-3p的表達水平在ACHN細胞系與786-O細胞系中分別被敲低了71.79%和74.59%。見圖4。

五、miR-195-3p提高腎癌細胞增殖水平

在786-O細胞系中，與轉(zhuǎn)染mimic NC相比，轉(zhuǎn)染miR-195-3p mimic于24、48、72 h的增殖水平提高了3.65%(P<0.05)、10.37%(P<0.05)、25.34%(P<0.01)；與轉(zhuǎn)染inhibitor NC相比，轉(zhuǎn)染miR-195-3p inhibitor于24、48、72 h的增殖水平下降了4.38%(P<0.01)、 9.83%(P<0.01)、8.29%(P<0.01)。見圖5。

在ACHN細胞系中，與轉(zhuǎn)染mimic NC相比，轉(zhuǎn)染miR-195-3p mimic于24、48、72 h的增殖水平提高了5.42%(P<0.01)、10.88%(P<0.01) 和17.78%(P<0.01)，與轉(zhuǎn)染 inhibitor NC相比，轉(zhuǎn)染miR-195-3p inhibitor于24、48、72 h的增殖水平下降了5.69%(P<0.05)、9.21%(P<0.01) 和 6.41%(P<0.01)。見圖6?？梢姡琺iR-195-3p可以提高腎癌細胞的增殖水平，故miR-195-3p可促進腎癌細胞生長。

圖1　miR-195-3p在腎癌及相應(yīng)的癌旁組織中的相對表達倍數(shù)分析(X軸Normal代表正常組織，Cancer代表腎癌組織，Y軸代表腎癌組織相對癌旁組織的表達倍數(shù))圖2　miR-195-3p在腎癌和相應(yīng)的癌旁組織中的相對表達量比值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后結(jié)果(X軸代表組織例數(shù)，Y軸代表腎癌與相應(yīng)的癌旁組織中的相對表達量比值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后結(jié)果)圖3　miR-195-3p在ACHN、786-O、769P、293T中的相對表達量(X軸為4種細胞系，Y軸是miR-195-3p在ACHN、786-O、769P、293T相對于293T的表達量)圖4　轉(zhuǎn)染后miR-195-3p在ACHN與786-O細胞系表達水平圖5　786-O細胞系中轉(zhuǎn)染后細胞增殖水平的OD值變化(X軸表示時間，Y軸表示OD值大小)圖6　ACHN細胞系中轉(zhuǎn)染后細胞增殖水平的OD值變化(X軸表示時間，Y軸表示OD值大小)

討論

RCC是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，約占成人惡性腫瘤的2%[11]。基于RCC的臨床結(jié)果和生物特性，RCC主要分為透明細胞癌、乳頭狀癌、嫌色細胞癌等幾種病理類型[12]。而透明細胞癌是最常見的RCC病理類型，約占RCC的80%[4]。與大多數(shù)腫瘤相同，腎癌發(fā)生發(fā)展的具體機制暫不明確，手術(shù)切除依然是RCC唯一確定的治療措施，但是仍然有20%～40%的患者在行腎切除術(shù)后面臨著復(fù)發(fā)的可能[13]。故而尋找可用于腎癌早期診斷或治療的藥物顯得更為重要。

據(jù)近期文獻報道，miR-195在許多類型的癌癥中發(fā)揮著十分重要的作用，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌等[14-16]。推測，miR-195可能是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵。實驗研究證實miR-195通過直接針對細胞周期蛋白D1和E1的3’UTRs來抑制人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖[14]。miR-195通過bcl-2(23) 促進細胞凋亡和抑制結(jié)腸、直腸的致瘤性[15]。在乳腺癌組織中miR-195表達下調(diào)，誘導(dǎo)miR-195的表達能促進細胞凋亡并能抑制乳腺癌的生存細胞，數(shù)據(jù)顯示miR-195能夠結(jié)合Raf-1 mRNA 的3’UTR從而抑制Raf-1的表達[16]。Subramanian等[17]的研究表明miR-195是Raf-1表達的直接負調(diào)節(jié)物并且同時抑制Raf-1和MEK激酶使結(jié)腸癌細胞凋亡增加。在肝細胞癌和胰腺癌中miR-195的表達也是下調(diào)的[18-19]。

有關(guān)miR-195作為結(jié)腸癌生物標(biāo)志物的研究表明[17]， miR-195表達下調(diào)與結(jié)腸癌預(yù)后差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。miR-195在子宮頸癌、骨肉瘤、腎上腺皮質(zhì)癌和乳腺癌中也被描述為生物標(biāo)志物[20-24]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-195對乳腺癌檢測具有更高的靈敏度[25]。低表達水平的miR-195可以顯著預(yù)測HER2陽性乳腺癌患者的生存率[23]。也有文獻報道血清中miRNA(miR-16-2*，miR-195，miR-2861，miR-497)可用于高精度辨別宮頸上皮內(nèi)瘤變[23]。而下調(diào)的miR-195可以預(yù)測預(yù)后不良的骨肉瘤或腎上腺皮質(zhì)癌[20-21]。由上可見，miR-195可作為診斷、靶向治療或預(yù)后多種癌癥的潛在的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-195-3p在腎癌中表達上調(diào)，提示其在腎癌中的作用機制與其他腫瘤有所不同。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示miR-195-3p在腎癌中明顯高表達，其表達水平為癌旁正常組織的(4.344±0.482)倍，提示其可能在腎癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促癌基因的作用。統(tǒng)計學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)miR-195-3p的表達水平與患者年齡、性別、臨床病理特征、TNM分期、AJCC臨床分期之間的聯(lián)系，但這不能排除其與臨床病例數(shù)偏少所造成的偏倚誤差有關(guān)，需要更大的樣本量才能進一步對實驗進行驗證。細胞增殖實驗中，在786-O及ACHN細胞系中miR-195-3p可提高腎癌細胞增殖水平。

現(xiàn)通過實驗已明確miR-195-3p在腎癌及其癌旁組織中的表達存在差異，下一步將收集更多的實驗標(biāo)本，以驗證miR-195-3p的表達水平與患者年齡、性別、臨床病理特征、TNM分期、AJCC臨床分期之間是否存在一定的聯(lián)系。并用體外轉(zhuǎn)染的實驗方法對miR-195進行其他的功能方面的研究，主要包括腎癌細胞的轉(zhuǎn)染后侵襲、凋亡等。這些研究將有助于闡明腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，并對腎癌的早期診斷及其治療與判斷預(yù)后起到至關(guān)重要的作用。

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(本文編輯：徐漢玲)

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81101922)；深圳市科技研發(fā)資金知識創(chuàng)新計劃基礎(chǔ)研究項目(JCYJ20130402114702124、JCYJ20150403091443329)；廣東省重點醫(yī)學(xué)專科經(jīng)費

通信作者：來永慶，E-mail:yqlord@163.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.02.009

Corresponding author:LAI Yong-qing,E-mail:yqlord@163.com

(收稿日期：2016-01-08)

The expression and clinical significance of miR-195-3p in renal cell carcinoma

PANXiang*,QUANJing,JINLu,GUIYao-ting,YANGShang-qi,MAOXiang-ming,LAIYong-qing.

*AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression level of miR-195-3p in the renal cell carcinoma(RCC)， paired normal tissues, RCC cell lines and normal kidney cell line, and analyze the relationships between the expression level of miR-195-3p and clinicopathologic of patients and explore its clinical significance.MethodsTotal RNA was isolated from 27 RCC tissues and paired adjacent normal tissues. Reverse transcription and real time quantitative PCR (qRT-PCR) were used to detect the expression of miR-195-3p. The relationships between the expression of miR-195-3p in tissues and cell lines with clinicopathologic characteristics was analyzed. To assess the function of miR-195-3p in RCC cell lines, cell proliferation assay (MTT) were performed on cells after up-regulating or down-regulating miR-195-3p.ResultsThe expressionof miR-195 in RCC tissues and cells was significantly higher than paired adjacent normal tissues and cells (P<0.05), and 18 (66.67%) RCC tissues showed up-regulation in all tissues which had detected miR-195-3P. The results showed that there were no relationships between the expression of miR-195-3P with patients’gender, age, histology, TNM stage and AJCC stage (P>0.05).Over-expression of miR-195-3p could promote RCC cell (786-O and ACHN) proliferation, while down-regulation of miR-195-3p could suppress cell proliferation. ConclusionsmiR-195-3P is up-regulated in RCC tissue, and promotes the proliferation of RCC cells. It is indicated that miR-195-3P might be involved in the tumorigenesis and development of RCC.

【Key words】Kidney neoplasms;miR-195-3p