王友寶　張梁　韓韜　徐向前　祝昌明　王磊　夏青建　郭小剛

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·實驗研究·

膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表達(dá)水平及臨床意義

王友寶張梁韓韜徐向前祝昌明王磊夏青建郭小剛

266000 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)泌尿外科

【摘要】目的研究miR-126與miR-152在膀胱癌患者尿液中的表達(dá)，評估二者作為膀胱癌早期診斷標(biāo)志物的價值。方法采用RT-PCR技術(shù)檢測52例膀胱癌患者和40例健康對照者尿液中miR-126、miR-152的表達(dá)，并通過受試者工作曲線(ROC)分析其診斷效能。結(jié)果miR-126在早期膀胱癌患者尿液中表達(dá)顯著升高(t=6.350，P<0.01)，且與膀胱癌的惡性程度有關(guān)；膀胱癌患者尿液中miR-152表達(dá)降低(t=3.996，P<0.05)，但與膀胱癌的臨床病理特征均無關(guān)(P>0.05)；miR-126聯(lián)合miR-152能夠很好地鑒別膀胱癌，敏感性和特異性分別為76.5%、83.6%。結(jié)論尿液中的miR-126能夠反映膀胱癌的惡性程度，miR-126聯(lián)合miR-152對膀胱癌的早期診斷具有潛在的價值。

【關(guān)鍵詞】膀胱腫瘤；尿液；MicroRNAs；腫瘤標(biāo)志物

膀胱癌是我國最常見的泌尿系惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高，早期診斷對膀胱癌的篩查、治療至關(guān)重要[1]。膀胱鏡檢查和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查是目前最常用的檢查手段，前者為有創(chuàng)檢測，患者不易接受[2]。后者雖為一種無創(chuàng)傷性手段，但是敏感性僅有35%[3]。 MicroRNAs(miRNAs)是一種包含19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA[4]，近年研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs能在膀胱癌患者尿液中穩(wěn)定表達(dá)，對尿液中某些差異表達(dá)的miRNAs加以研究或為臨床提供一種新型的無創(chuàng)診斷標(biāo)志物[5]。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測膀胱癌患者尿液中 miR-126、miR-152的表達(dá)變化，并通過受試者工作曲線(ROC)分析二者診斷的敏感性和特異性，探討二者作為一種新型腫瘤標(biāo)志物的診斷價值。

材料與方法

一、實驗對象

2013年11月至2015年8月在我院泌尿外科收治入院的52例初發(fā)膀胱腫瘤患者，其中男36例，女16例，年齡37～84歲，平均64歲。參照WHO 1973病理分級系統(tǒng)和UICC臨床分期系統(tǒng)，其中高級別20例，低級別32例；非肌層浸潤性38例，肌層浸潤性14例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①尿液收集前2周無泌尿系侵入性檢查史；②既往無手術(shù)、放療或化療史；③未合并泌尿系感染、結(jié)石及其他部位腫瘤；④患者或家屬簽署知情同意書，并遵照醫(yī)囑正確留取尿液。所入選疑似膀胱腫瘤患者均經(jīng)病理證實為膀胱尿路上皮癌。同期體檢的40例健康志愿者作為對照組，其中男26例，女14例，年齡35～75歲，平均62歲。對照組各項檢查結(jié)果正常，組間性別、年齡均無統(tǒng)計學(xué)差異。

二、主要試劑和儀器

Trizol試劑購于Invitrogen公司，Real-Time PCR Kit(LK-0101A)、總RNA提取試劑盒均購自上海Novland公司。所用儀器主要包括Stratagene公司生產(chǎn)的MX3000P型實時熒光定量PCR儀、日立產(chǎn)U2000紫外可見分光光度計、 Eppendorf 公司生產(chǎn)的EP5417R型臺式低溫高速離心機(jī)。

三、方法

1.尿液的收集及總RNA的提?。菏占軝z者中后段晨尿100 ml，并在2 h內(nèi)于4 ℃下、3 000 g離心15 min去除尿液沉渣，然后將上清再次以12 000 g 離心10 min，用去RNA酶處理過的 EP管收集上清1.5 ml，做好標(biāo)記立即放在液氮中速凍并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?yán)格參照Invitrogen公司Trizol說明書提取凍存尿液上清中的總RNA，并使用紫外線分光光度計測定230、260和280 nm的吸收值，計算RNA的純度和濃度，以篩選達(dá)標(biāo)樣本做后續(xù)實驗。

2.引物的設(shè)計與合成：引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由Novland公司合成，具體序列參照表1。

表1　用于實時定量PCR的引物

3.RT-PCR：以2 μl的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用miR-126、miR-152的特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，于PCR擴(kuò)增儀26 ℃孵育30 min、42 ℃ 孵育30 min、85 ℃孵育10 min，結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物置于冰塊上防止降解。實時熒光定量PCR的反應(yīng)過程如下：變性95 ℃，3 min；退火95 ℃，12 s; 延伸60 ℃，40 s，擴(kuò)增40個循環(huán)后對結(jié)果進(jìn)行分析，以U6RNA作為內(nèi)參基因，測定循環(huán)閾值(CT)，采用2-△△CT的方法計算miR-126、miR-152的相對表達(dá)強(qiáng)度(RQ)，其中 ΔΔCT=膀胱癌組(CT目的miRNA-CTU6) -健康對照組(CT目的miRNA-CTU6)。每個樣本每個基因3個重復(fù)，精密度滿足進(jìn)一步分析要求。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、尿液中miR-126、miR-152的表達(dá)水平

健康對照組中miR-126、miR-152的表達(dá)水平分別為2-△△CT=2.16±1.33、2-△△CT=1.03±0.22。與健康對照組相比，膀胱癌患者尿液中的miR-126表達(dá)顯著升高(2-△△CT=9.49±5.51，t=6.350，P<0.01)，且尿液中miR-126的表達(dá)與膀胱癌的惡性程度有關(guān)(P<0.05)，惡性程度越低miR-126的表達(dá)升高越顯著；而尿液中miR-152表達(dá)相對降低(2-△△CT=0.89±1.29，t=3.996，P<0.05)，但與膀胱癌的臨床病理特征均無關(guān)(P>0.05)，詳見表2。本實驗中膀胱癌患者尿液中miR-126/miR-152比值遠(yuǎn)高于正常對照組(t=7.602，P<0.01)，但其比值在不同腫瘤分期、分級間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2　膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性±s)

二、尿液中miR-126、miR-152的臨床診斷價值及效能

鑒于miR-152普遍低表達(dá)，所以結(jié)合高表達(dá)的miR-126應(yīng)該有更好的診斷價值，圖1為ROC分析miR-126及其與miR-152比值對膀胱腫瘤的診斷價值曲線，當(dāng)最佳切點定在15.11時，miR-126/miR-152比值診斷膀胱癌的特異性和敏感性分別為83.6%、76.5%，診斷效能均比單獨采用miR-126要好，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表3。

表3　尿液中miR-126、miR-152對膀胱腫瘤診斷價值的ROC曲線分析

圖1　尿液中兩種miRNA對膀胱腫瘤診斷的ROC曲線

討論

膀胱癌作為一種高度異質(zhì)性的疾病，一旦發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移預(yù)后極差[6]，因此亟需一種新型的腫瘤標(biāo)志物提高早期診斷率。膀胱鏡檢查是目前術(shù)前診斷和術(shù)后隨訪的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然在檢查過程中能夠很好的直觀病灶以及取樣活檢，但是患者往往很抵觸這種昂貴且痛苦的侵入性檢查，另外一些平坦型病變或原位癌也是膀胱鏡檢查的盲區(qū)[2]；尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查是一種無創(chuàng)傷性手段，但敏感性太低，且泌尿系的結(jié)石、感染、取尿和檢測技術(shù)差異也常會影響尿細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果[3]。近年來膀胱癌患者尿液腫瘤標(biāo)志物的研究受到很大的關(guān)注， FDP、BTAstat、 ImmunoCyt、BTAtrak、NMP22和尿熒光原位雜交技術(shù)(FISH)已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)并用于膀胱癌的檢測，另外一些潛在的標(biāo)志物如存活素、端粒酶、CYFRA21-1等也在膀胱癌的臨床研究中顯示出了較高的特異性和敏感性，但由于炎癥、結(jié)石、放療史等干擾因素使得這些腫瘤標(biāo)志物的特異性仍然普遍低于尿細(xì)胞學(xué)檢查[7-9]。因此，至今仍然沒有一種理想的非侵入性檢查手段應(yīng)用于膀胱癌的術(shù)前診斷與術(shù)后隨訪。

理想的生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)該具有高靈敏度和特異性、取材與檢查方便快捷、成本低廉，miRNAs在多種泌尿系腫瘤中的表達(dá)改變和生物學(xué)功能受到極大關(guān)注。一些miRNAs的表達(dá)水平確實在腫瘤組織和正常組織中存在差異[10]，而尿液中存在的miRNAs和尿路上皮腫瘤也有著千絲萬縷的聯(lián)系，由于尿液與腫瘤組織的直接接觸，腫瘤細(xì)胞及其釋放的相關(guān)miRNAs會在尿液中有著不同程度的表達(dá)[11]，因此選取尿液中某些異常表達(dá)的miRNA加以研究有可能成為早期診斷和治療膀胱腫瘤的突破點[12]。

尿液是泌尿系疾病診斷中最理想的檢測載體，取樣無創(chuàng)性，患者容易接受。尿液中的miRNAs能夠很好的耐受pH值和高活性的RNase，在室溫下放置24 h內(nèi)不易降解，這使得尿液中穩(wěn)定存在的miRNAs更利于臨床檢測[13]。由于尿液中的miRNAs主要來自脫落的上皮細(xì)胞以及由尿路上皮細(xì)胞主動釋放的以微囊泡、外泌體等形式包裹的miRNAs，使得尿液中miRNAs具有極高的特異性[14]。 miR-126和miR-152 是腫瘤研究的熱點因子，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-152 在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)水平相比健康組織明顯下調(diào)[15]，同樣膀胱癌患者尿液中的miR-152 水平也要普遍低于健康對照組[16]；此外， miR-126在膀胱癌患者尿液中的表達(dá)水平也明顯高于健康對照組[17]，本實驗我們也證實了miR-126在膀胱癌患者尿液中高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)miR-126與腫瘤的臨床分期和病理級別密切相關(guān)，能很好的評估膀胱癌的惡性程度。經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-126/miR-152的比值診斷膀胱癌的特異性和敏感性分別為83.6%、76.5%，這種診斷效能也已經(jīng)相當(dāng)高，提示二者結(jié)合具有很好的診斷潛力，對患者治療方案的選擇和預(yù)后評估都會有一定的意義。

然而本實驗仍然存在一些不足之處，本次納入樣本量偏少，目前內(nèi)參基因的選擇也存在爭議，另外市場上也缺乏專門針對尿液中miRNAs的檢測試劑等。盡管這些研究數(shù)據(jù)需要經(jīng)受長期的臨床試驗，但不失為當(dāng)今臨床診斷開辟一條新的思路，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，一種精確可行的非侵入型腫瘤標(biāo)志物會有更好的應(yīng)用前景。

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(本文編輯：熊鈺芬)

基金項目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0226)

通信作者：王友寶，E-mail:734182987@qq.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.02.010

Corresponding author:WANG You-bao,E-mail:734182987@qq.com

(收稿日期：2016-01-04)

The expression of urine miR-126, miR-152 in bladder cancer and its clinical value

WANGYou-bao,ZHANGLiang,HANTao,XUXiang-Qian,ZHUChang-ming,WANGLei,XIAQing-jian,GUOXiao-gang.

DepartmentofUrology,QingdaoHiserHospital,Qingdao266000,China

【Abstract】ObjectiveTo explore urine miR-126, miR-152 expression in bladder cancer and evaluate its clinical value as early diagnosis markers.MethodsUrine miR-126, miR-152 of 40 cases of healthy controls and 52 patients with bladder cancer were assayed by RT-PCR, and its diagnostic value was evaluated by the ROC curve.ResultsThe expression of urine miR-126 in bladder cancer patients was significantly raised (t=6.350, P<0.01), it significantly correlated with malignant degree. But the expression of urine miR-152 was downregulated (t=3.996, P<0.05), while not related to clinicopathological features (P>0.05), miR-126 combine with miR-152 identifying bladder cancer was commendable, the sensitivity and specificity was 76.5%, 83.6% respectively.ConclusionsUrine miR-126 can response to the malignant degree of bladder cancer, miR-126 combined with miR-152 has potential value to the early diagnosis of bladder cancer.

【Key words】Urinary bladder neoplasms;Urine;MicroRNAs;Tumor markers