季曉宇 鞠曉梅 湯 賀 姜 萌 羅來(lái)鵬 劉宇軒 侯毅鞠
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A549細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法的改進(jìn)
季曉宇鞠曉梅湯賀姜萌羅來(lái)鵬劉宇軒侯毅鞠
吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院
季曉宇(1995-)女(漢族),河北省保定市人,在讀本科;通訊作者:侯毅鞠(1974-)女(漢族),吉林省吉林市人,副教授,碩士學(xué)位,主要從事血液腫瘤相關(guān)的研究工作。
行業(yè)曲線
起始于20世紀(jì)早期的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)作為生命科學(xué)研究最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié),隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,如培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞是研發(fā)抗腫瘤新藥的常規(guī)技術(shù) 。A549是1972年由Giard DJ通過(guò)肺癌組織移植培養(yǎng)建系的一種肺癌細(xì)胞。我們以A549細(xì)胞為例,研究細(xì)胞培養(yǎng)中最基本但又很關(guān)鍵的凍存與復(fù)蘇的方法和條件,使A549凍存復(fù)蘇后獲得最高生物學(xué)特性,推動(dòng)后期實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)材料
A549肺癌細(xì)胞,RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司),胎牛血清(四季青),DMSO(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司),胰蛋白酶(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司),CO2培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,超凈工作臺(tái)。
實(shí)驗(yàn)方法
A549細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代
在溫度為37℃±1、CO2濃度為5%培養(yǎng)箱內(nèi),用胎牛血清為10%的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%即可傳代培養(yǎng):棄去培養(yǎng)液后加入適量胰酶,37℃消化1~2 min,見有細(xì)小白沙狀物順瓶底滑脫,顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形,細(xì)胞間隙增大后,立即加入完全培養(yǎng)液終止消化,收集細(xì)胞懸液,800 r·min-1,5min離心,去掉上清,加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基以后吹打混勻,按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
不同濃度DMSO凍存A549細(xì)胞
常用的細(xì)胞凍存液為含10%二甲基亞砜、20%胎牛血清、70% RPMI-1640的培基。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞,待貼壁生長(zhǎng)至80%~90%時(shí),按前述方法消化細(xì)胞,待消化充分后,收集細(xì)胞懸液進(jìn)行離心,將細(xì)胞分成密度相同的 4 組,凍存保護(hù)液DMSO終濃度依次為 5%、10%、15%、20%分裝于凍存管,冷凍保存。15天后取出,置于37℃水浴中輕輕晃動(dòng),迅速溶解,800 r·min-1,5min離心,去掉上清,加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基以后吹打混勻,于溫度為37℃±1、CO2濃度為5%培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
A549細(xì)胞的復(fù)蘇
選擇凍存條件最優(yōu)的細(xì)胞(10%DMSO濃度凍存的A549細(xì)胞),選用兩種不同方法來(lái)復(fù)蘇。第1組:凍存管立即放于37℃水浴,輕晃至融化后加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,800 r·min-1離心5min,棄去上清,加入培養(yǎng)基混勻后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。第2組采用改良復(fù)蘇方法:立即將凍存管置于42℃水浴快速融化,加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,800 r·min-1離心5min,棄去上清,加入培養(yǎng)基混勻后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。兩組均靜置12 h后,更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
復(fù)蘇細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
培養(yǎng)24h后行瑞士染色,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及其生長(zhǎng)狀況。
臺(tái)盼藍(lán)染色法判斷A549細(xì)胞存活率
細(xì)胞培養(yǎng)12h后用臺(tái)盼藍(lán)染液計(jì)數(shù),每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù) 500個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)3次取平均值。在顯微鏡下觀察,死細(xì)胞被染成深藍(lán)色;活細(xì)胞邊緣光滑且胞體透明、染色很淡。計(jì)數(shù)3個(gè)不重疊視野的未藍(lán)染細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞的平均存活率。
圖1
繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
分別取復(fù)蘇后的細(xì)胞,調(diào)整濃度為6×106·mL-1接種培養(yǎng)。以h為橫坐標(biāo),以細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)繪制出生長(zhǎng)曲線,比較不同濃度二甲基亞砜?jī)龃婕?xì)胞,及不同復(fù)蘇方法的差異。
A549細(xì)胞復(fù)蘇形態(tài)學(xué)觀察
倒置顯微鏡下:濃度為5%、10%、15%的DMSO凍存細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁狀態(tài)較好,形態(tài)較凍存之前無(wú)明顯變化或有多角形;20%濃度DMSO細(xì)胞生長(zhǎng)較慢,可為多角形。兩種復(fù)蘇方法比較,改良復(fù)蘇方法細(xì)胞形態(tài)較好。
臺(tái)盼藍(lán)拒染法判斷A549細(xì)胞的存活率
5%、10%、15%、20%、DMSO的凍存A549細(xì)胞的復(fù)蘇存活率分別為(87.60±1.26)%、(88.07±2.07)%、(87.17±1.31)%、(42.53±1.10)%;t=2.920,p<0.05,分別組間比較5%、10%、15%二甲基亞砜組凍存A549 細(xì)胞復(fù)蘇率與 20%二甲基亞砜組, 差異顯著(t=1.49~78.32,P均 < 0.05)。傳統(tǒng)復(fù)蘇方法與改良復(fù)蘇方法細(xì)胞存活率分別為(88.07±2.07)%、(90.67±1.48)%;t=2.920,p<0.05。組間比較無(wú)顯著差異(t=2.69,p>0.05).
A549細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
不同濃度DOMS凍存液(圖1a)
由圖可看出5%、10%、15%二甲基亞砜濃度凍存細(xì)胞較快達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。20%濃度凍存細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,對(duì)細(xì)胞損害較大。
不同復(fù)蘇方法(圖1b)
如圖可見兩種復(fù)蘇方法無(wú)顯著差異。
細(xì)胞體外培養(yǎng)凍存復(fù)蘇以后的生長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)對(duì)許多生物學(xué)試驗(yàn)的效果產(chǎn)生直接影響,而其凍存復(fù)蘇后的生長(zhǎng)狀態(tài)則主要與凍存保護(hù)劑的種類、濃度和細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的方法條件及培養(yǎng)基血清濃度等有關(guān)。細(xì)胞凍存在低溫環(huán)境下,其活力代謝與生化反應(yīng)基本保持靜止?fàn)顟B(tài),故冷凍保存時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)細(xì)胞影響較小或無(wú)明顯影響。所用凍存液種類、濃度及降溫的速率是凍存細(xì)胞取得良好效果的關(guān)鍵。
本研究選用不同DMSO濃度的凍存保護(hù)液凍存A549細(xì)胞。結(jié)果顯示 5%、10% 和 15%組DMSO保存效果最佳明顯優(yōu)于20%組, 且10%組優(yōu)于 5% 和 15%組,但無(wú)明顯差異;當(dāng) DMSO增至 20%濃度時(shí),細(xì)胞的復(fù)蘇率下降明顯。細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜,可使溶液冰點(diǎn)降低,加之在緩慢凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)水分透出,減少了冰晶形成,從而避免細(xì)胞損傷,故應(yīng)用10%濃度的DMSO凍存A549細(xì)胞較好。
復(fù)蘇細(xì)胞原則為越快越好,在進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),傳統(tǒng)的方法是37℃水浴融化后離心培養(yǎng),改良的復(fù)蘇方法是42℃水浴中溶解,37℃水浴至融化后離心培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中改良后細(xì)胞生長(zhǎng)情況與傳統(tǒng)復(fù)蘇方法無(wú)顯著差異。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅僅是本試驗(yàn)中所涉及到的幾點(diǎn),還受諸如培養(yǎng)的溫度、濕度、CO2濃度等多個(gè)條件和因素的影響。若能協(xié)調(diào)好眾多的影響因素,盡可能降低細(xì)胞損傷,進(jìn)一步改善細(xì)胞復(fù)蘇與凍存技術(shù),保證細(xì)胞活力, 可以隨時(shí)提供生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,以便更有效地促進(jìn)A549細(xì)胞在藥物敏感性研究、肺癌發(fā)病機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及誘導(dǎo)分化、藥物治療誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及評(píng)價(jià)細(xì)胞毒試驗(yàn)等方面的廣泛應(yīng)用。
基金項(xiàng)目:吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.2012489;No.2012338);2013年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目
DOI:10.3969/j.issn.1001- 8972.2016.13.027