蔡麗,劉毅,陸小青(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

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針刺對(duì)卒中后抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及海馬CA3區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響

蔡麗,劉毅,陸小青
(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

【摘要】目的觀察針刺百會(huì)、印堂、四神聰穴對(duì)卒中后抑郁(PSD)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)水平的影響。方法將30只成年雄性SD大鼠,按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照組、針刺組及假手術(shù)組,每組10只。采用經(jīng)典的線栓大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)法加用慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)建立大鼠PSD模型。于應(yīng)激開(kāi)始第14天開(kāi)始,針刺組予以針刺干預(yù),連續(xù)干預(yù)14 d。應(yīng)激結(jié)束后1星期進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn),評(píng)價(jià)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶功能。水迷宮測(cè)試結(jié)束后用免疫組化法測(cè)定海馬CA3區(qū)BDNF的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較,對(duì)照組大鼠學(xué)習(xí)能力顯著下降(P＜0.05),反映記憶功能的空間探索時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)均顯著降低,分別是(22.36±6.20)s與(48.73±5.40)s、(3.72±0.90)次與(8.60±1.10)次,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。PSD大鼠經(jīng)針刺治療后,與對(duì)照組比較,學(xué)習(xí)能力及空間探索時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)、BDNF表達(dá)均顯著提高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論針刺治療可改善卒中后抑郁大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能,提高卒中后抑郁大鼠模型海馬區(qū)BDNF水平。

【關(guān)鍵詞】針刺;中風(fēng)并發(fā)癥;抑郁癥;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;記憶障礙;大鼠

卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是腦卒中后最常見(jiàn)的神經(jīng)精神并發(fā)癥,可嚴(yán)重影響腦卒中患者神經(jīng)功能、認(rèn)知功能及日常生活能力,成為影響患者功能恢復(fù)和卒中復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]。近年來(lái),腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在應(yīng)激所致學(xué)習(xí)記憶損傷機(jī)制中的作用愈來(lái)愈引起人們的重視。BDNF主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá),不僅對(duì)神經(jīng)元的生存、生長(zhǎng)、分化有重要的影響,而且還能增強(qiáng)突觸聯(lián)系,影響神經(jīng)元的可塑性,與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)[3]。前期研究發(fā)現(xiàn),針刺治療可以改善卒中后抑郁患者的抑郁狀況,提高卒中后抑郁大鼠模型皮質(zhì)區(qū)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平[4-5]。本研究旨在通過(guò)建立PSD動(dòng)物模型,予以針刺干預(yù),進(jìn)一步探討針刺治療對(duì)PSD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及海馬CA3區(qū)BDNF表達(dá)變化的關(guān)系,為研究針刺治療PSD學(xué)習(xí)記憶障礙的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36 只,3月齡,體重(220±20)g,上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。所有大鼠分籠喂養(yǎng)于循環(huán)房?jī)?nèi),溫度(23±2)℃,濕度60%,光/暗周期為12/l2 h,適應(yīng)飼養(yǎng)1星期,自由攝食、飲水。每日逐只撫摸捉拿大鼠,使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。其間進(jìn)行蔗糖水消耗訓(xùn)練,1星期后進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)行為評(píng)分,測(cè)定蔗糖水消耗和曠場(chǎng)試驗(yàn)基線值。

1.1.2儀器與試劑

Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司XR-XM101),恒溫浴槽(XR-XM101-D2)、日本OLYMPUS攝影顯微鏡(CH型)、moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)、電熱吹風(fēng)機(jī)、兔抗BDNF多克隆抗體、BDNF免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),10%水合氯醛、4%多聚甲醛溶液等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模方法

采用經(jīng)典的線栓法大腦中動(dòng)脈阻塞手術(shù)(MCAO)建立腦缺血模型,加用慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng),建立大鼠PSD模型。MCAO模型參照改良的Koizumi方法建立[6]。術(shù)后24 h按Longa EZ等[7]標(biāo)準(zhǔn)行神經(jīng)功能評(píng)分。CUMS在MCAO術(shù)后7 d開(kāi)始(神經(jīng)功能缺損已基本恢復(fù)),按Willner P[8]和Katz RJ方法[9]略改進(jìn),將①禁食、禁水20 h;②禁水17 h;③傾斜鼠籠(45℃)17 h;④持續(xù)光照17 h;⑤濕籠(100 g鋸屑加200 mL水)21 h;⑥4℃水中游泳5 min;⑦水平搖晃5 min;⑧行為限制2 h;⑨夾尾1 min;共9種刺激每天隨機(jī)采取1種,共安排21 d。孤養(yǎng),即單籠飼養(yǎng)[10]。用蔗糖水消耗試驗(yàn)評(píng)價(jià)抑郁模型的可靠程度[11]。

1.2.2動(dòng)物分組與處理

選取測(cè)定蔗糖水消耗量相近的大鼠30只,按照SPSS13.0生成隨機(jī)數(shù)字表,隨機(jī)分為對(duì)照組、針刺組和假手術(shù)組,每組10只。對(duì)照組和針刺組大鼠予以線栓法大腦中動(dòng)脈阻塞加用慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)處理,假手術(shù)組大鼠接受相同手術(shù)流程,但不插入線栓,不進(jìn)行應(yīng)激和孤養(yǎng)處理,旨在排除手術(shù)對(duì)大鼠抑郁狀態(tài)的影響。

1.2.3干預(yù)方法

應(yīng)激開(kāi)始第14天開(kāi)始對(duì)針刺組大鼠予以針刺干預(yù),參照大鼠腦立體定位圖譜[12],采用前囟定位,采用《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[13]中有關(guān)大鼠穴位定位方法,針刺大鼠百會(huì)、印堂、四神聰穴。使用0.30 mm×13 mm毫針(華佗牌,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)針刺治療。百會(huì)、印堂、四神聰均為斜刺,深度均為0.2～0.3 mm,每次留針30 min,每隔10 min行針1次,每天1次,連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.4Morris水迷宮測(cè)試

測(cè)試在應(yīng)激干預(yù)結(jié)束后1星期參照相關(guān)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行,包括定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分,其中定位航行實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試學(xué)習(xí)功能,空間探索實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試記憶功能。

定位航行實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀測(cè)大鼠的逃避潛伏期來(lái)檢測(cè)其學(xué)習(xí)記憶能力,即從入水到找到并爬上平臺(tái)所需時(shí)間。前5 d進(jìn)行定位航行訓(xùn)練,將大鼠分別從不同象限頭面向池壁投入水中,計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤并分析大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期,如果120 s仍未找到平臺(tái),則人為引到平臺(tái)并停留30 s,此時(shí)逃避潛伏期記錄為120 s。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練4次(分別從不同的象限入水),每次訓(xùn)練之間間隔10 min,連續(xù)訓(xùn)練5 d,將每天記錄的4次逃避潛伏期取平均值,作為大鼠當(dāng)天的學(xué)習(xí)指標(biāo)。5 d訓(xùn)練結(jié)束后撤除平臺(tái),在水池第三象限周邊壁上做明顯標(biāo)記(黑色三角),開(kāi)始空間探索實(shí)驗(yàn)。將大鼠放入任一象限,分析60 s內(nèi)大鼠在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間(空間探索時(shí)間)和跨平臺(tái)次數(shù),作為記憶能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

每次訓(xùn)練之間和4次訓(xùn)練完成后,迅速將大鼠洗凈擦干,用吹風(fēng)機(jī)吹干,以防大鼠低體溫。訓(xùn)練結(jié)束后清洗游泳路線及側(cè)壁以消除嗅覺(jué)對(duì)測(cè)試的影響。

1.2.5海馬組織處理及海馬CA3區(qū)BDNF檢測(cè)

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉,置于木板平臺(tái)上,打開(kāi)胸腔,生理鹽水心臟灌流。取腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定6 h,再置入30%蔗糖溶液中,待組織下沉?xí)r取海馬組織石蠟包埋。常溫下連續(xù)經(jīng)海馬矢狀切片,片厚5mm,每6張切片選一張用以研究,用鏈霉素抗生物素蛋白生物素復(fù)合物法(strept-avidin-biotin complex,SABC)行BDNF組織化學(xué)染色,免疫組化染色法按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。每張切片400倍鏡下攝片,每組取不連續(xù)10個(gè)視野的均值,顯微鏡觀察陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)并攝片,借助圖像分析軟件Simple PCI(V5.2,compix Inc德國(guó))進(jìn)行定量分析。陽(yáng)性表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)中,膠質(zhì)細(xì)胞有部分表達(dá),呈黃色或棕色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,差別以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中由于意外等原因,對(duì)照組與針刺組各死亡1只大鼠。

2.1各組大鼠不同時(shí)期糖水消耗量比較

在應(yīng)激第14天后,對(duì)照組、針刺組糖水消耗量較假手術(shù)組明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在針刺干預(yù)第7天后,針刺組糖水消耗量較對(duì)照組有明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明試驗(yàn)建立的卒中后抑郁模型是有效的,經(jīng)過(guò)針刺治療干預(yù),糖水消耗量的提高證明了針刺治療的有效性。詳見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠不同時(shí)期糖水消耗量比較(±s,%)

表1　各組大鼠不同時(shí)期糖水消耗量比較(±s,%)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與對(duì)照組比較2)P＜0.01

組別　n　應(yīng)激前　應(yīng)激第6天　應(yīng)激第14天(干預(yù)第1天)應(yīng)激第21天(應(yīng)激結(jié)束,干預(yù)第7天) 第28天(干預(yù)第14天)假手術(shù)組　10　85.74±12.31　82.16±11.85　86.17±10.12　84.54±12.28　87.32±13.35對(duì)照組　9　86.03±12.51　80.81±16.21　63.25±12.451)　52.36±13.14　44.77±15.78針刺組　9　86.68±13.25　79.67±14.38　64.38±13.121)　67.14±13.15　75.63±11.272)

2.2各組大鼠定位航行學(xué)習(xí)能力比較(逃避潛伏期比較)

自訓(xùn)練第2天開(kāi)始,對(duì)照組逃避潛伏期的時(shí)間明顯長(zhǎng)于同時(shí)點(diǎn)的假手術(shù)組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而針刺組與對(duì)照組比較,逃避潛伏期的時(shí)間明顯短于同時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。結(jié)果表明卒中后抑郁影響大鼠的學(xué)習(xí)能力,而針刺干預(yù)可有效改善這一影響。詳見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較(±s,s)

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較(±s,s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與對(duì)照組比較2)P＜0.01

組別　n　第1天　第2天　第3天　第4天　第5天假手術(shù)組　10　103.23±8.30　91.16±7.80　65.18±6.40　42.53±7.20　21.30±6.70對(duì)照組　9　112.04±9.10　104.76±6.90　83.26±7.401)　72.38±8.20　52.77±7.601)針刺組　9　108.69±7.70　97.66±6.40　69.35±6.401)　51.13±8.10　30.33±7.202)

2.3各組大鼠空間搜索能力比較

3組大鼠間空間探索時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),對(duì)照組記憶功能受損最明顯。經(jīng)針刺干預(yù)治療后,針刺組大鼠的記憶功能顯著提高,與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明卒中后抑郁大鼠的記憶能力下降,而針刺干預(yù)治療可有效改善PSD大鼠的記憶能力。詳見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠空間探索時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)比較　(±s)

表3　各組大鼠空間探索時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)比較　(±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與對(duì)照組比較2)P＜0.01

組別　n　空間探索時(shí)間(s)　跨平臺(tái)次數(shù)(n)假手術(shù)組　10　48.73±5.40　8.60±1.10對(duì)照組　9　22.36±6.20　3.72±0.901)針刺組　9　36.59±5.70　6.96±1.302)

2.4各組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF表達(dá)水平比較

3組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少,針刺組較對(duì)照組有所提高。詳見(jiàn)表4。

表4　各組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(±s,個(gè))

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與對(duì)照組比較2)P＜0.01

組別　n　陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組　10　68.20±6.50對(duì)照組　9　40.50±5.801)針刺組　9　59.60±7.102)

2.5各組大鼠BDNF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

海馬區(qū)BDNF免疫組化陽(yáng)性反映在神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)中,膠質(zhì)細(xì)胞有部分表達(dá),呈黃色或棕色。從結(jié)果看,對(duì)照組BDNF水平明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01),而針刺組明顯高于對(duì)照組(P＜0.01),說(shuō)明針刺治療可促進(jìn)BDNF的表達(dá)水平。詳見(jiàn)圖1。

圖1　各組大鼠海馬區(qū)BDNF免疫組化染色結(jié)果(?400)

3　討論

卒中后抑郁是指卒中后出現(xiàn)的以情緒低落、興趣減退、消極悲觀、易激惹、淡漠、失眠、焦慮,甚至出現(xiàn)自殺傾向?yàn)橹饕憩F(xiàn)的病癥,是卒中常見(jiàn)并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響患者的認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶水平[15-17]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病位在腦竅,肝腎虧虛、氣郁痰阻為其基本病機(jī)[18-20],所以PSD的治療當(dāng)醒腦開(kāi)竅解郁為主[21-24]。百會(huì)穴位居顛頂部,其深處即為腦之所在,為督脈經(jīng)穴,督脈又歸屬與腦。根據(jù)《靈樞·衛(wèi)氣》理論,“頭氣有街”“氣在頭者,止之于腦”“腦為髓?！?百會(huì)為調(diào)節(jié)大腦功能的要穴[25-27]。印堂、四神聰均為經(jīng)外奇穴,有寧心安神、醒腦開(kāi)竅的作用[28-31]。前期研究顯示[5],針刺百會(huì)、印堂、四神聰穴可以改善PSD患者的抑郁狀況,提高PSD大鼠模型皮質(zhì)區(qū)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平,為針刺治療PSD可能與調(diào)節(jié)皮質(zhì)區(qū)單胺類(lèi)遞質(zhì)平衡提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)家族的重要一員,廣泛分布于成年哺乳動(dòng)物和人體的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng),主要由海馬和大腦皮質(zhì)合成,對(duì)神經(jīng)元的存活、分化及損傷后修復(fù)方面發(fā)揮重要作用,可促進(jìn)海馬神經(jīng)再生,逆轉(zhuǎn)突觸丟失,改善細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),恢復(fù)學(xué)習(xí)與記憶功能。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,對(duì)照組和針刺組較假手術(shù)組,逃避潛伏期時(shí)間增長(zhǎng)、停留時(shí)間(空間探索時(shí)間)和跨平臺(tái)次數(shù)減小,表明卒中后抑郁影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。針刺組糖水消耗量較對(duì)照組明顯增高,逃避潛伏期的時(shí)間明顯縮短,空間探索時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)增多,表明針刺干預(yù)可有效改善抑郁對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響。從海馬CA3區(qū)BDNF檢測(cè)結(jié)果分析,對(duì)照組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組,而針刺組明顯高于對(duì)照組,說(shuō)明針刺治療可促進(jìn)BDNF的表達(dá)水平,改善抑郁癥狀。

因此,我們認(rèn)為腦卒中抑郁可導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶能力下降,針刺治療可以改善PSD大鼠學(xué)習(xí)空間記憶功能,這可能與針刺可以提高大腦海馬區(qū)BDNF水平有關(guān),但有關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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【中圖分類(lèi)號(hào)】R2-03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.04.0462

文章編號(hào):1005-0957(2016)04-0462-04

收稿日期2015-07-20

基金項(xiàng)目:上海市教委預(yù)算內(nèi)項(xiàng)目(2012JW60);上海市青年醫(yī)師培養(yǎng)項(xiàng)目;上海市中醫(yī)醫(yī)院優(yōu)青項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介:蔡麗(1984-),女,主治醫(yī)師,碩士,Email:cailiys@163.com

Effect of Acupuncture on Spatial Learning and Memory Abilities and Hippocampal CA3 Regional BDNF in Rats with

Post-stroke Depression

CAI Li,LIU Yi,LU Xiao-qing.
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Municipal Hospital

of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of acupuncture at points Baihui(GV20),Yintang(Ex-HN3)and Sishencong (Ex-HN1)on spatial learning and memory abilities and hippocampal expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in a rat model of post-stroke depression(PSD).MethodThirty male adult SD rats were allocated,using a random number table,tocontrol, acupuncture and sham operation groups,10 rats each.A rat model of PSD was made by classical middle cerebral artery occlusion (MCAO)using an intraluminal thread technique,chronic unpredictable mild stress(CUMS)and solitary feeding.At the fourteenth day after the beginning of stress,the acupuncture group received acupuncture intervention for 14 consecutive days.At one week after the end of stress,the Morris water maze test was conducted to assess rat spatial learning and memory abilities.After the completion of the water maze test,hippocampal CA3 regional BDNF expression was determined by immunohistochemical method. ResultRat learning and memory abilities decreased significantly in the control group compared with the sham operation group(P ＜0.05).Space exploration time and the number of crossing platform reflecting memory abilities decreased significantly in the control group(22.36±6.20 s and 3.72±0.90 times,respectively)compared with the sham operation group(48.73±5.40 s and 8.60±1.10 times,respectively);there were statistically significant differences(P＜0.01).Learning abilities,space exploration time, the number of crossing platform and BDNF expression increased significantly in PSD rats treated with acupuncture compared with the control group;there were statistically significant differences(P＜0.01).ConclusionAcupuncture can improve spatial learning and memory abilities and raise hippocampal regional BDNF levels in rats with post-stroke depression.

[Key words]Acupuncture;Stroke complications;Depression;Brain-derived neurotrophic factor;Dysmnesia;Rats?