唐利宇 孟楣 張賀 江瑩 許坡 張靜 王芳

摘要：目的 以雷公藤內(nèi)酯酮為指標(biāo)，考察黃芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量變化，以期推斷其可能配伍減毒機(jī)制。方法 采用高效液相色譜法比較分析黃芪配伍雷公藤前后毒性成分雷公藤內(nèi)酯酮含量變化，從化學(xué)成分層次分析其減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)變化，并結(jié)合中藥七情中“相畏相殺”理論，推斷其可能配伍減毒機(jī)制。結(jié)果 含量測定試驗(yàn)中黃芪配伍雷公藤的雷公藤內(nèi)酯酮平均含量（0.42×10-3 mg/mL）明顯低于單味雷公藤的雷公藤內(nèi)酯酮含量（0.54×10-3 mg/mL），說明黃芪配伍雷公藤后降低了雷公藤內(nèi)酯酮的含量。結(jié)論 黃芪與雷公藤配伍可降低雷公藤毒性。

關(guān)鍵詞：雷公藤內(nèi)酯酮；黃芪；高效液相色譜法；相畏相殺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.023

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0087-04

雷公藤Triptergium wilfordii Hook. f.系衛(wèi)矛科Celastraceae雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，味辛、苦，性寒，歸肝、腎經(jīng)，常作為臨床上治療風(fēng)濕頑痹之要藥?，F(xiàn)代藥理及臨床研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1-5]，特別是近幾年研究發(fā)現(xiàn)其具有

抗HIV病毒作用和對阿爾茨海默病的治療作用[6]，引起藥理、毒理及臨床學(xué)者的關(guān)注。但因其有大毒，尤其主要活性成分二萜類（如雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮）的毒性較強(qiáng)，在很大程度上限制了雷公藤在臨床上的應(yīng)用[7-8]。有學(xué)者基于文本挖掘技術(shù)探討雷公藤用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)雷公藤與黃芪配伍在臨床應(yīng)用中頻率最高[9]。本課題組前期毒理學(xué)研究顯示，雷公藤與黃芪配伍較單味雷公藤毒性明顯降低[10]。本研究以雷公藤內(nèi)酯酮為指標(biāo)，考察黃芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量變化，以期推斷其可能的配伍減毒機(jī)制[11-12]。

1 儀器與試藥

安捷倫1260液相色譜儀（美國Agilent公司），Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），BP211D電子天平（德國賽多利斯），HDM-1000數(shù)顯控溫電熱套（江蘇省金華市榮壇儀器制造有限公司），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金華市榮壇儀器制造有限公司），HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠），RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠），KQ-3200 DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DZF-6020真空干燥箱（鞏義市英峪予華儀器廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），101A-S1型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司），DF-10A搖擺式中藥粉碎機(jī)（溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司）。

黃芪，合肥天星樂家老鋪中藥飲片有限公司，批號12072102；雷公藤，合肥天星樂家老鋪中藥飲片有限公司，批號12072102。所用藥材均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李立華教授鑒定符合現(xiàn)行藥典規(guī)定。雷公藤內(nèi)酯酮對照品，北京盛世康普化工技術(shù)研究院，純度≥98%，批號20130826；甲醇為色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20130918；水為屈臣氏蒸餾水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：welch material Inc C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-水溶液（55∶45）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：218 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取雷公藤內(nèi)酯酮對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.021 5 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 雷公藤藥材干燥后打成細(xì)粉，過40目篩，取藥材粉末10 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加75%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量乙醇、回流2.0 h，第2次加8倍量乙醇、回流1.5 h，合并醇提液，過濾，回收乙醇。藥渣加8倍量水煎煮提取1.5 h，過濾，吸取上清液，同醇提液合并減壓濃縮收膏，真空干燥，得干浸膏。將所得的干浸膏置索氏提取器中，加150 mL乙酸乙酯-甲醇（15∶1）于提取器中，于約97 ℃水浴中回流4 h，將回流液揮干部分溶劑，濃縮至約20 mL左右時轉(zhuǎn)移至已用30 mL乙酸乙酯預(yù)洗的中性氧化鋁（100～200目）的層析柱中，再以80 mL乙酸乙酯洗脫，收集流出液和洗脫液，于水浴鍋中蒸除乙酸乙酯，殘渣用甲醇超聲5 min以上使充分溶解，定容于5 mL容量瓶中，過0.45 ?m微孔濾膜，作為雷公藤供試品溶液。取雷公藤藥材10 g、黃芪20 g（均過40目篩），其余供試品溶液提取步驟同上，定容于5 mL容量瓶中，過0.45 ?m微孔濾膜，作為雷黃組供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，吸取對照品溶液、雷公藤供試品溶液、雷黃組供試品溶液各10 ?L，分別注入色譜儀，進(jìn)行測定。對照品及樣品色譜圖見圖1。從色譜圖中可以看出，兩供試品色譜圖中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，在相同保留時間有對應(yīng)的色譜峰。在此色譜條件下，雷公藤內(nèi)酯酮達(dá)到基線分離，樣品中其他成分對雷公藤內(nèi)酯酮的測試無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 ?L、按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量（?g）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1958.5X-2.446 7（r=0.999 9），結(jié)果表明雷公藤內(nèi)酯酮進(jìn)樣量在0.043～0.258 ?g范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述對照品溶液各10.0 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算RSD，結(jié)果峰面積RSD=1.00%，表明儀器精密度較好，符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備的雷公藤供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定并記錄峰面積，計算RSD。結(jié)果峰面積RSD=1.38%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，符合要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號的雷公藤藥材6份，約10 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制成雷公藤供試品溶液，精密吸取10 ?L，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。結(jié)果雷公藤中雷公藤內(nèi)酯酮含量RSD=1.58%，表明本試驗(yàn)重復(fù)性較好，符合要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量同一產(chǎn)地、同一批號的雷公藤藥材，共6份，約10 g，精密稱定，按照試驗(yàn)要求，分別加入一定體積的配制好濃度的雷公藤內(nèi)酯酮對照品溶液（0.20 mg/mL），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，過0.22 ?m微孔濾膜，按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

2.9 供試品含量測定

取3份10 g雷公藤、3份10 g雷公藤和20 g黃芪，分別按供試品溶液制備方法制備3份雷公藤供試品溶液和3份雷黃組供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣，計算雷公藤內(nèi)酯酮含量，結(jié)果見表2?？芍?，雷黃組中的雷公藤內(nèi)酯酮含量低于雷公藤中的雷公藤內(nèi)酯酮含量，說明黃芪配伍雷公藤后降低了雷公藤內(nèi)酯酮的含量。

3 討論

配伍是中醫(yī)方劑學(xué)的核心內(nèi)容，藥物七情理論是中藥配伍理論的核心部分?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)·序錄》云：“若有毒宜制，可用相畏相殺者?！薄跋辔废鄽ⅰ蓖ㄟ^抑制或消除毒副作用達(dá)到全面兼顧、拮抗或消除毒性。臨床以黃芪配伍雷公藤，使其共同形成一種相互對立、相互依存、缺一不可的相畏相殺關(guān)系，達(dá)到相制相成、存利除弊、調(diào)偏、制毒的目的。辛苦之藥雷公藤，引燥為勝；黃芪性甘、微溫，補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表。剛燥大毒雷公藤配伍甘溫柔潤黃芪，以甘溫柔潤制其剛燥大毒，溫煦與司腠理開闔[13-14]。

雷公藤內(nèi)酯酮是雷公藤中的環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，此類結(jié)構(gòu)對高溫、酸堿較敏感，故在熱水堿中內(nèi)酯結(jié)構(gòu)容易開環(huán)。黃芪的主要有效成分是黃芪苷，實(shí)驗(yàn)測得其提取液呈弱堿性，以黃芪配伍雷公藤后，黃芪苷的弱堿性使雷公藤內(nèi)酯酮開環(huán)，從而降低了指標(biāo)成分的含量。故筆者推斷以上就是黃芪配伍雷公藤降低雷公藤毒性的可能作用機(jī)制。本課題組后期將進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步驗(yàn)證雷公藤內(nèi)酯酮含量的變化與配伍減毒的相關(guān)性，揭示中藥配伍的可能作用機(jī)制。

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