石少敏　王　靜　趙建軍　趙永娟

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林　長春　130033)

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siRNA肌細(xì)胞特異性增強因子2D對人肺癌細(xì)胞株A549和H460增殖及凋亡的影響

石少敏王靜趙建軍趙永娟

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林長春130033)

〔摘要〕目的探討siRNA肌細(xì)胞特異性增強因子(MEF)2D對人肺癌A549和H460細(xì)胞增殖的影響及可能的機制。方法RT-PCR檢測正常組織和肺癌組織內(nèi)MEF2D mRNA的表達(dá)水平，siRNA MEF2D轉(zhuǎn)染A549和H460細(xì)胞，MTT和流式細(xì)胞儀分別檢測不同處理組的細(xì)胞存活率和凋亡率，Western印跡檢測MEF2D和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果MEF2D mRNA在肺癌組織中的含量比在正常組織內(nèi)高，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA MEF2D后，細(xì)胞的存活率和MEF2D表達(dá)水平下降，而細(xì)胞的凋亡率和cleaved caspase-3的表達(dá)水平增加。結(jié)論siRNA MEF2D抑制了A549和H460細(xì)胞的增殖并促進了其凋亡。

〔關(guān)鍵詞〕siRNA；肌細(xì)胞特異性增強因子2D；肺癌；凋亡

最近有研究報道肌細(xì)胞特異性增強因子2D(MEF2D)參與了人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展〔1，2〕。但它在肺癌中的具體分子機制還不是十分清楚。本文旨在探討抑制MEF2D對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料臨床正常肺組織樣本以及肺癌組織樣本(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460細(xì)胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均為Sigma 公司產(chǎn)品，主要試劑β-actin、cleaved caspase-3購于自美國Santa Cruz公司。MEF2D抗體購于美國BD公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)購于 Millipore 公司。PI 試劑購于Pharmingin公司，OMEGA試劑盒購于北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司，PCR儀(LightCycler2.0型)為瑞士Roche公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀(FACScaliber)為美國 BD公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞銖A549和H460細(xì)胞株在含有10%新鮮生牛血清(BSA)、青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 U/ml)的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶進行消化，按1∶4比例進行傳代。

1.3siRNA-MEF2D轉(zhuǎn)染A549和H460細(xì)胞及表達(dá)檢測利用lipofectamine2000 將 siRNA-MEF2D及對照siRNAs(廣州銳博公司購買)分別轉(zhuǎn)染A549和H460細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，提取蛋白。BSA分析試劑測定蛋白質(zhì)濃度。30 μg總蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后5%全脂牛奶封閉2 h。將鼠源性單克隆抗體MEF2D(1∶1 000)一抗與膜孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3×10 min；羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)二抗(1∶1 000)與膜孵育1 h，PBS洗膜3×10 min；采用ECL試劑盒進行化學(xué)發(fā)光檢測。β-actin為內(nèi)對照(1∶2 000)。

1.4RT-PCR法在mRNA水平檢測MEF2D的表達(dá)采用OMEGA試劑盒提取組織和細(xì)胞的總RNA，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA。MEF2D引物：上游5′-AGGGAAATAACCAAAAAACTACCAAA-3′，下游5′-GCTACATGAACACAAAAACAGAGACC-3′；GAPDH引物：上游5′-GCGAGATCGCACTCATCATCT-3′，下游5′-TCAGTGGTGGACCTGACC-3′。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄42℃ 30 min；95℃10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR循環(huán)條件為94℃ 60 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s；30個循環(huán)后，72℃ 10 min終止延伸。 取RT-PCR產(chǎn)物在 1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，采用UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)做積分吸光度測定和分析。

1.5細(xì)胞毒性試驗MTT法檢測MEF2D siRNA、control siRNA對A549和H460細(xì)胞增殖的影響。取對數(shù)生長期A549和H460 細(xì)胞，以8 000個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后加藥，分為3組：調(diào)零孔(只含培養(yǎng)液DMEM，無細(xì)胞)、對照組(含0.1% DMSO的DMEM 培養(yǎng)液)以及實驗組。每組均設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后轉(zhuǎn)染MEF2D siRNA、control siRNA，轉(zhuǎn)染6 h后換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄上清，然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，即可棄去孔板內(nèi)的液體，再每孔加入150 μl DMSO，放于平板振蕩器上振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測每孔光密度(OD)值(570 nm波長)。每次實驗重復(fù)3次，取平均值，細(xì)胞抑制率=1-(藥物組吸光度/對照組吸光度)×100%，計算各組細(xì)胞存活率。

1.6Annexin V-FITC/PI 染色后流式細(xì)胞儀檢測凋亡率將A549和H460細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞長至約75%融合，轉(zhuǎn)染MEF2D siRNA、control siRNA，轉(zhuǎn)染6 h后換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌后80%冰乙醇固定。-20℃過夜。檢測前PBS沖洗細(xì)胞1次，制成單細(xì)胞懸液，再加入6 μl Annexin V-FITC，最后加入4 μl PI，室溫避光孵育15 min后上機檢測，每組重復(fù)3次。

1.7Western印跡檢測不同處理組的A549和H460細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3表達(dá)水平①按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白；②采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后結(jié)合一抗(cleaved caspase-3工作濃度為1∶1 000)，第2天加入對應(yīng)的二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1.5 h，洗膜3次，ECL顯色液顯影，β-actin 為內(nèi)參。提取結(jié)果并分析數(shù)據(jù)。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS10.0 軟件進行one-way ANOVA分析、t檢驗。

2結(jié)果

2.1正常組織和肺癌組織內(nèi)MEF2D mRNA表達(dá)水平MEF2D mRNA在正常組織中表達(dá)量(0.35±0.067)很低，而在肺癌組織中表達(dá)表達(dá)量(1.02±0.055)很高，兩者之間差異顯著(P<0.05)。

2.2siRNA MEF2D對A549和H460細(xì)胞內(nèi)MEF2D蛋白的抑制效率siRNA MEF2D及陰性對照轉(zhuǎn)染A549和H460細(xì)胞后，siRNA MEF2D明顯減弱了A549和H460細(xì)胞內(nèi)MEF2D蛋白的表達(dá)。在A549和H460細(xì)胞內(nèi)siRNA MEF2D組與siRNA

control 組之間差異顯著(P<0.05)。見表1，圖1。

2.3siRNA MEF2D對A549和H460細(xì)胞存活率的影響siRNA MEF2D抑制了肺癌細(xì)胞的增殖。在A549和H460細(xì)胞內(nèi)siRNA MEF2D組與siRNA control 組之間差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.4siRNA MEF2D對A549和H460細(xì)胞凋亡率的影響siRNA MEF2D增加了A549和H460細(xì)胞的凋亡水平。在A549和H460細(xì)胞內(nèi)siRNA MEF2D組與siRNA control 組之間差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.5siRNA MEF2D對A549和H460細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響siRNA MEF2D增加了兩種細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平。在A549和H460細(xì)胞內(nèi)siRNA MEF2D組與siRNA control 組之間差異顯著(P<0.05)。見表1，圖2。

圖1　細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA MEF2D后MEF2D蛋白的表達(dá)

指標(biāo)A549siRNAcontrolA549siRNAMEF2DH460siRNAcontrolH460siRNAMEF2DMEF2D蛋白0.68±0.050.082±0.0221)0.45±0.0470.072±0.0192)細(xì)胞存活率(%)100±1.8558.9±1.111)100±2.5155.3±0.852)細(xì)胞凋亡率(%)4.31±0.4237.2±1.31)3.86±0.3336.8±0.672)cleavedcaspase-3蛋白0.068±0.030.55±0.0511)0.053±0.0240.43±0.022)

與A549 siRNA control組比較：1)P<0.05；與H460 siRNA control組比較：2)P<0.05

圖2　siRNA MEF2D對凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3的影響

3討論

MEF2s起初被認(rèn)為是對肌細(xì)胞分化起到至關(guān)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，隨后被證實參與許多生物學(xué)過程，包括肌肉組織和神經(jīng)系統(tǒng)的分化、心臟的形態(tài)發(fā)生、血管的形成和生長因子調(diào)控能力〔3〕。此外，MEF2D在很多細(xì)胞中發(fā)揮著促存活的作用，環(huán)磷酸腺苷-蛋白酶A信號系統(tǒng)會通過負(fù)調(diào)控MEF2D的功能誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)元的凋亡〔4〕。MEF2s主要包括A、B、C和D四種亞型。MEF2的N端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)DNA結(jié)合活性和二聚體的形成；而C端結(jié)構(gòu)域的主要作用是作為轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域〔5，6〕。MEF2s通常在腫瘤組織中高表達(dá)，在遺傳程序激活方面發(fā)揮的作用已經(jīng)在很多細(xì)胞內(nèi)得到了驗證。已有研究表明MEF2C和MEF2D分別通過激活VEGF信號通路和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖促進了癌癥的發(fā)展〔7〕。Yu等〔8〕證明了沉默MEF2D能通過抑制RPRM和CDKN1A的表達(dá)誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期G2/M期停滯，最終引發(fā)了細(xì)胞凋亡。但MEF2D在人肺癌細(xì)胞中的作用還不是很清楚。本實驗結(jié)果表明，MEF2D在肺癌組織中表達(dá)量要比正常組織中高。通過SiRNA方法成功沉默了MEF2D的表達(dá)，與SiRNA control組相比，沉默MEF2D能抑制肺癌細(xì)胞的增殖并促進了凋亡。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-10-19修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：王靜(1976-)，女，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2873-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.021

第一作者：石少敏(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事肺癌診治方面的研究。