侯建波，謝　文，李　杰，陸　順，祝澤龍，姚濱濱

(1.浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，浙江 杭州　310016；2.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州　310016；3.浙江立德產(chǎn)品技術(shù)有限公司，浙江 杭州　310016)

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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶和奶粉中5種非蛋白含氮化合物

侯建波1,2，謝文1,2，李杰3，陸順3，祝澤龍3，姚濱濱3

(1.浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，浙江 杭州310016；2.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州310016；3.浙江立德產(chǎn)品技術(shù)有限公司，浙江 杭州310016)

摘要：建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定牛奶和奶粉中地昔尼爾、雙氰胺、縮二脲、環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺 5種非蛋白含氮化合物的方法。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白并提取，正己烷脫脂，HLB固相萃取柱凈化，LC-MS/MS法檢測，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法定量分析。結(jié)果表明：地昔尼爾、雙氰胺、縮二脲、環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺在牛奶樣品中的定量限(S/N=10)分別為0.5、2.5、20、5、15 μg/kg，在奶粉樣品中的定量限(S/N=10)分別為8、35、50、40、50 μg/kg；方法的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.991；回收率為72.4%～102.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～12.3%。采用該方法檢測55批次牛奶和奶粉樣品中5種化合物的殘留情況，其中陽性樣品的測定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果一致，驗證了方法的可靠性。該方法簡便、快捷，定量限可滿足目前國內(nèi)外最大殘留限量的要求，可作為乳制品中相關(guān)化合物殘留量的測定方法。

關(guān)鍵詞：牛奶；奶粉；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；非蛋白含氮化合物；同時測定

奶制品是人類最古老的天然飲品之一，由于物美價廉、營養(yǎng)豐富、食用方便、容易消化吸收，被稱為“白色血液”。隨著人民對牛奶營養(yǎng)價值認(rèn)可度的不斷提高，對其品質(zhì)要求也越來越高，牛奶中的含氮量是判定牛奶品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。以凱氏定氮法為代表的測定方法可以實現(xiàn)樣品中粗蛋白含量的測定[1]，但無法區(qū)分氮的來源，使得非蛋白氮摻假無法得到有效控制。非蛋白氮摻假乳制品嚴(yán)重危害人體健康，其中以2008年三鹿公司的“三聚氰胺事件”最為突出，2012年在新西蘭乳品巨頭恒天然的部分奶制品中檢測到了雙氰胺殘留。一些國家和地區(qū)對食品中非蛋白含氮化合物的使用進(jìn)行了明確的限量規(guī)定：美國和歐盟規(guī)定畜產(chǎn)品中環(huán)丙氨嗪最高殘留量為0.05 mg/kg；2002年我國農(nóng)業(yè)部《動物性食品中獸藥殘留最高限量》規(guī)定環(huán)丙氨嗪在禽產(chǎn)品中的最高殘留限量為0.05 mg/kg，在羊肌肉、脂肪、肝、腎中的最高殘留限量為0.3 mg/kg；2011年衛(wèi)生部規(guī)定乳制品中三聚氰胺的最高殘留限量為嬰幼兒配方乳粉1 mg/kg，液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉和其他配方乳粉2.5 mg/kg，含乳15%以上的其他食品2.5 mg/kg。

目前，對三聚氰胺、雙氰胺及其類似物的測定方法有分光光度法[2-4]，紅外光譜法[5]，氣相色譜-質(zhì)譜法[6]，高效液相色譜法[7-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]。我國制定了一系列檢測標(biāo)準(zhǔn)[13-15]，實現(xiàn)了檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。隨著分離分析技術(shù)的發(fā)展，多殘留同時檢測的手段也逐步被開發(fā)[16-18]，然而，關(guān)于乳制品中多種非蛋白含氮化合物同時檢測的報道仍然較少。

本工作擬采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶和奶粉中地昔尼爾(dicyclanil)，雙氰胺(dicyandiamide)，縮二脲(biuret)，環(huán)丙氨嗪(cyromazine)和三聚氰胺(melamine)，并將測定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 22388—2008進(jìn)行比較，驗證方法的可靠性，希望為乳制品中相關(guān)化合物殘留量的檢測提供一種簡便快捷的方法。

1實驗部分

1.1主要儀器與裝置

1260-6490型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源；固相萃取裝置：美國Supelco公司產(chǎn)品； R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；氮吹儀：美國Organomation公司產(chǎn)品；臺式離心機：美國Thermo 公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；HLB柱：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2主要材料與試劑

乙腈、正己烷、甲醇和甲酸：均為色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品；實驗用水：Milli-Q高純水；氨水：分析純，上海國藥集團(tuán)產(chǎn)品；地昔尼爾、雙氰胺、縮二脲、環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺以及同位素內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于98%，美國Sigma公司產(chǎn)品；用乙腈溶解各化合物，稀釋并定容，獲得10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，實驗時根據(jù)需要用乙腈將其稀釋至所需濃度。

1.3實驗方法

1.3.1樣品的提取稱取1.00 g牛奶樣品和1.25 g奶粉樣品(精確至0.01 g)，分別置于50 mL具塞離心試管中；用水溶解奶粉樣品，并定容至10 mL；準(zhǔn)確移取1 mL樣品溶液，添加100 ng三聚氰胺-15N3內(nèi)標(biāo)物，加乙腈至20 mL，渦旋60 s，超聲10 min，再以8 500 r/min離心5 min，取10 mL上清液；加入7 mL正己烷，渦旋，去除上層正己烷相，將下層溶液濃縮至近干，待凈化。

1.3.2樣品的凈化向上述殘渣中加入3 mL 5%氨化乙腈進(jìn)行溶解，渦旋，過HLB固相萃取柱，重復(fù)操作1次；收集6 mL洗脫溶液，減壓濃縮至近干；用乙腈-含5 mmol/L乙酸銨的0.15%甲酸水溶液(9∶1，V/V)定容至2 mL，過0.22 μm濾膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3色譜條件色譜柱：XBridge HILIC柱(4.6 mm×150 mm×3.5 μm)；流動相：A為含5 mmol/L乙酸銨的0.15%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～3.0 min、10%～50%A，3.0～8.0 min、50%A，8.0～9.0 min、50%～10%A，9.0～20.0 min、10%A；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。

1.3.4質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓：3 500 V；離子源溫度：250 ℃；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：16 L/min；霧化氣壓力：275.8 kPa；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：10 L/min。其他質(zhì)譜條件列于表1。

表1　各化合物的基本信息及質(zhì)譜測定條件

注：*表示定量離子對

2結(jié)果與討論

2.1提取溶劑的選擇

本實驗考察了三氯乙酸沉淀蛋白和有機溶劑沉淀蛋白兩種提取方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在牛奶中直接加入三氯乙酸進(jìn)行蛋白沉淀凈化，其提取溶劑較難濃縮，測定的化合物信號響應(yīng)很低。通過考察甲醇和乙腈沉淀蛋白的情況，發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀蛋白比較徹底；而采用甲醇沉淀蛋白時，對提取溶液進(jìn)行濃縮后仍發(fā)現(xiàn)有白色固體析出。因此，本實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2凈化條件的選擇

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定易受測試溶液背景的干擾，因此需要采取凈化的方式來降低基質(zhì)背景的影響。本實驗分別考察了正己烷脫脂、QuEChERS和固相萃取(SPE)3種凈化方式，并選擇MCX、HLB、C18等不同類型的固相萃取柱進(jìn)行凈化效果的比較。結(jié)果顯示：采用乙腈飽和的正己烷可對提取后的溶液進(jìn)行有效地脫脂，且不影響回收率，同時可以降低雜質(zhì)背景的干擾。采用QuEChERS(主要填料為MgSO4、C18和PSA)凈化時，雙氰胺和地昔尼爾的回收率較好，均大于70%，但其他化合物的回收率并不理想，僅為30%～50%。采用固相萃取柱凈化時，MCX固相萃取柱對地昔尼爾、環(huán)丙氨嗪、三聚氰胺3個化合物的回收率為60%～80%，對其他2個化合物的回收率僅為30%左右；采用直接上樣接收的方式進(jìn)行凈化時，HLB柱的凈化效果好于C18柱，且使用氨化乙腈代替乙腈可明顯提高洗脫效率。綜合考慮以上結(jié)果，本實驗采用正己烷脫脂和HLB固相萃取柱凈化的方式進(jìn)行前處理。

2.3液相色譜條件的優(yōu)化

本實驗測定的化合物極性較大，參考文獻(xiàn)[15]選擇HILIC色譜柱對其進(jìn)行分析測試?？紤]到酸性環(huán)境可以提高化合物的離子化效率，加入乙酸銨能夠進(jìn)一步改善峰形，因此本研究采用正交實驗的方式，綜合考察了乙腈、甲醇、0.15%甲酸水溶液、含5 mmol/L乙酸銨的0.15%甲酸水溶液為定容溶液和流動相時的分離效率、譜峰峰形和信號強度。結(jié)果顯示：流動相為乙腈和0.15%甲酸水溶液時(梯度洗脫)，譜峰的峰形和強度較好，加入5 mmol/L乙酸銨可明顯提高各化合物的信號強度，其中地昔尼爾的強度可提高近50倍。地昔尼爾譜峰峰形受外界因素的影響較大，當(dāng)定容溶液與流動相初始溶液一致時，譜峰峰形較好，二者不一致時則會出現(xiàn)“分叉”峰。因此，本實驗選擇乙腈和含5 mmol/L乙酸銨的0.15%甲酸水溶液作為流動相和定容溶液，該條件下，各化合物在脫脂牛奶中的分離出峰情況示于圖1。

2.4質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化

在正離子模式下，采用流動注射的方式對待測化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋和母離子全掃描，以確定分子離子峰；再分別以待測化合物的分子離子為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，各化合物主要的子離子及可能的碎片信息示于圖2。按照歐盟EC/657指令進(jìn)行化合物定量確證必須滿足4個識別點的要求(母離子1點，特征子離子1.5點/個)，選擇2個特征子離子，其中以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對。以多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果列于表1。

圖1　脫脂牛奶中5種化合物的色譜圖

2.5線性關(guān)系和方法定量限

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定量測定時，基質(zhì)通常具有增強或抑制效應(yīng)。本實驗考察了溶劑線性和空白提取基質(zhì)溶液加標(biāo)線性工作曲線定量計算的情況，濃度相當(dāng)于樣品中含有0、50、100、200、400 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品(其中三聚氰胺-15N3的濃度為50 μg/L)。結(jié)果顯示，兩種工作曲線定量結(jié)果的偏差大于15%，說明存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，采用添加同位素內(nèi)標(biāo)物和空白樣品提取液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液兩種方式相結(jié)合來減弱離子化時的基質(zhì)效應(yīng)，減小定量結(jié)果的偏差。

以待測物質(zhì)量濃度x(μg/kg)為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品與同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比值y為縱坐標(biāo)(外標(biāo)法以譜峰面積為縱坐標(biāo))，繪制各藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，得到線性方程，其線性相關(guān)系數(shù)R2>0.991。牛奶樣品中各藥物的方法定量限(S/N=10)為：地昔尼爾0.5 μg/kg、雙氰胺2.5 μg/kg、縮二脲20 μg/kg、環(huán)丙氨嗪5 μg/kg和三聚氰胺15 μg/kg；奶粉樣品中各藥物的方法定量限(S/N=10)為：地昔尼爾8 μg/kg、雙氰胺35 μg/kg、縮二脲50 μg/kg、環(huán)丙氨嗪40 μg/kg和三聚氰胺50 μg/kg。向空白牛奶和奶粉中添加各化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為50 μg/kg，測得的脫脂牛奶總離子流圖示于圖3。

圖2　5種化合物的質(zhì)譜圖和可能的結(jié)構(gòu)式

2.6回收率及精密度實驗

選用不含各類化合物的脫脂牛奶、全脂牛奶、脫脂奶粉、全脂奶粉和嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行3個濃度水平(50、100和200 μg/kg)的添加回收實驗，每個濃度水平取6個平行樣品，實驗結(jié)果列于表2。其中，地昔尼爾、雙氰胺、縮二脲和環(huán)丙氨嗪采用外標(biāo)法定量，三聚氰胺采用內(nèi)標(biāo)法定量，方法的總體回收率為72.4%～102.8%，整體相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～12.3%。

圖3　脫脂牛奶中各化合物MRM總離子流圖(添加濃度50 μg/kg)

化合物添加水平/(μg/kg)脫脂牛奶脫脂奶粉全脂牛奶全脂奶粉嬰幼兒配方奶粉回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%地昔尼爾5089.97.686.28.692.65.287.13.681.85.210094.14.395.78.285.92.784.37.785.76.520087.69.4102.24.596.12.896.17.296.06.3雙氰胺5088.36.293.27.596.59.587.24.383.68.810093.04.883.49.293.55.081.98.686.35.920099.74.093.46.788.43.995.27.697.711.0縮二脲5083.54.479.76.893.97.072.47.387.89.710099.67.995.611.295.87.381.09.591.77.120096.38.190.46.685.74.190.83.683.77.6環(huán)丙氨嗪5080.28.091.27.978.56.482.94.292.310.610096.45.780.56.297.99.990.31.399.811.620093.44.2101.42.784.66.287.38.781.012.3三聚氰胺5098.47.6102.83.5101.88.393.84.6100.03.3100100.46.9102.24.795.96.396.05.299.84.020094.43.9101.65.498.94.298.63.498.53.5

2.7實際樣品分析

應(yīng)用該方法對55個不同品牌和批次的進(jìn)出口脫脂牛奶、全脂牛奶、脫脂奶粉、全脂奶粉和嬰幼兒配方奶粉樣品進(jìn)行測定，有2個批次的全脂牛奶中含有三聚氰胺，含量分別為0.14 mg/kg和0.20 mg/kg。同時，采用GB/T 22388—2008方法對這2個批次的全脂牛奶進(jìn)行測定，也檢出了三聚氰胺，含量分別為0.16 mg/kg和0.19 mg/kg，二者基本一致。

3結(jié)論

建立了LC-MS/MS法同時測定牛奶和奶粉中5種非蛋白含氮化合物。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白和提取，正己烷脫脂，HLB固相萃取凈化后，采用LC-MS/MS法測定，外標(biāo)法和同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法定量，方法的總體回收率為72.4%～102.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～12.3%。該方法操作簡單、選擇性好、定量限能滿足目前國內(nèi)外的相關(guān)要求。應(yīng)用該方法對55批次牛奶和奶粉樣品中5種非蛋白含氮化合物的含量情況進(jìn)行測定，其中陽性樣品的測定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定的結(jié)果一致。

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收稿日期：2015-09-10;修回日期：2015-10-28

基金項目：浙江出入境檢驗檢疫局科研項目(ZK201428)資助

作者簡介：侯建波(1983—)，男(滿族)，內(nèi)蒙古人，高級工程師，從事食品中藥物殘留檢測研究。E-mail: houjb@ziq.gov.cn

中圖分類號：O657.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2997(2016)04-0336-07

doi：10.7538/zpxb.youxian.2016.0022

Simultaneous Determination of 5 Nitrogen-Rich Adulterants in Milk and Powdered Milk by LC-MS/MS

HOU Jian-bo1,2, XIE Wen1,2, LI Jie3, LU Shun3, ZHU Ze-long3, YAO Bin-bin3

(1.TheTechnicalCenterofZhejiangEntryExitInspectionandQuarantineBureau,Hangzhou310016,China;2.ZhejiangAcademyofScienceandTechnologyforInspectionandQuarantine,Hangzhou310016,China;3.ZhejiangLeadProductTechnicCo.Ltd.,Hangzhou310016,China)

Abstract:A method of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for the determination of five nitrogen-rich adulterants (dicyclanil, dicyandiamide, biuret, cyromazine, melamine) in milk and powdered milk samples. These compounds were potential to be used in economic adulteration to enhance the nitrogen content in milk products. The protein of sample was precipitated, and the extracts were dissolved and distilled with acetonitrile. The supernatant solution was extracted with n-hexane to remove the fat, and then cleaned up with SPE HLB cartridges. The quantitative detection was performed on LC-MS/MS by multiple reaction monitoring (MRM) mode under positive electrospray ionization (ESI+). Isotopes dilution internal standard method (melamine) or external standard method (dicyclanil, dicyandiamide, biuret and cyromazine) was used to determine the residue contents in samples. The limits of quantification (LOQs, S/N=10) are dicyclanil (0.5 μg/kg), dicyandiamide (2.5 μg/kg), biuret (20 μg/kg), cyromazine (5 μg/kg), melamine (15 μg/kg) for milk samples and dicyclanil (8 μg/kg), dicyandiamide (35 μg/kg), biuret (50 μg/kg), cyromazine (40 μg/kg), melamine (50 μg/kg) for powered milk samples. Single-laboratory method validation data are determined, the calibration standard curves concentration are 0, 50, 100, 200, 400 μg/kg and the correlation coefficients are more than 0.991. The average recovery is 72.4%-102.8%, and the relative standard deviation (RSD) is 1.3%-12.3%. The residues of 5 compounds in 55 batches of milk and milk powder samples are determined by LC-MS/MS, and the results are consistent with the national standard method (GB/T 22388—2008). This method is suitable for determination and confirmation of these compounds and provides a convenient, rapid and effective approach to proactively combat economically motivated adulteration in milk and powdered milk sample.

Key words：milk; powdered milk; liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); nitrogen-rich adulterants; simultaneous determination

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-03-28；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.002.html