戴　祁，鐘其頂，王道兵，武竹英，陳珊珊，肖冬光

(1.天津科技大學(xué)，天津　300457；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京　100015；3.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京　100015)

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散養(yǎng)與籠養(yǎng)雞蛋中穩(wěn)定碳氮同位素特征研究

戴祁1,2,3，鐘其頂2,3，王道兵2,3，武竹英2,3，陳珊珊2,3，肖冬光1

(1.天津科技大學(xué)，天津300457；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；3.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京100015)

摘要：建立了元素分析-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(EA-IRMS)聯(lián)用測(cè)定雞蛋各組分的碳氮穩(wěn)定同位素組成的方法，并初步探究了散養(yǎng)與籠養(yǎng)蛋雞生產(chǎn)的雞蛋的碳氮穩(wěn)定同位素分布特征。結(jié)果表明：利用該方法測(cè)定雞蛋各組分(蛋清、蛋黃、蛋殼膜)的碳氮同位素組成具有良好的重復(fù)性，SD值均不高于0.2‰(n=6)；雞蛋各組分的碳氮同位素組成存在差異，各組分δ13C值從大到小的順序依次為蛋殼膜>蛋清>蛋黃，各組分δ15N值從大到小的順序依次為蛋黃>蛋清>蛋殼膜，與δ13C值的變化規(guī)律相反；各組分δ13C值之間呈線性相關(guān)(R2分別為0.768，0.761，0.640)，各組分δ15N值之間也呈線性相關(guān)(R2分別為0.862，0.875，0.711)。對(duì)比散養(yǎng)和籠養(yǎng)生產(chǎn)的雞蛋，散養(yǎng)雞蛋蛋清中δ13C和δ15N值的分布范圍分別為-18.00‰～-14.97‰，3.02‰～4.37‰；籠養(yǎng)雞蛋蛋清中δ13C和δ15N值的分布范圍分別為-18.96‰～-15.98‰，1.66‰～2.68‰?？梢?jiàn)，結(jié)合δ13C和δ15N值，能夠有效地區(qū)分散養(yǎng)與籠養(yǎng)雞蛋。

關(guān)鍵詞：雞蛋；元素分析儀-同位素比值質(zhì)譜法(EA-IRMS)；飼養(yǎng)方式；鑒別

雞蛋含有大量的維生素、礦物質(zhì)及高生物價(jià)值的蛋白質(zhì)[1]，長(zhǎng)久以來(lái)一直是人類(lèi)最好的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一。市場(chǎng)上的雞蛋主要分為散養(yǎng)雞蛋、籠養(yǎng)雞蛋和有機(jī)飼養(yǎng)雞蛋。相比籠養(yǎng)雞，散養(yǎng)雞和有機(jī)飼養(yǎng)雞有更大的活動(dòng)空間，有機(jī)會(huì)自由的尋找食物，如蛆蟲(chóng)、甲蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)、草、種子等，可以少量食用或不食用化學(xué)合成的農(nóng)藥、化肥、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、抗生素、飼料添加劑等物質(zhì)。因此普遍認(rèn)為，按照散養(yǎng)方式和有機(jī)飼養(yǎng)方式生產(chǎn)的雞蛋更符合消費(fèi)者的消費(fèi)心理[2]。但由于散養(yǎng)和有機(jī)飼養(yǎng)方式生產(chǎn)的雞蛋生產(chǎn)投入成本較高[3]，相應(yīng)的市場(chǎng)價(jià)格也較高，有些不法商家在巨大利益的驅(qū)使下，以普通籠養(yǎng)雞蛋冒充散養(yǎng)、有機(jī)雞蛋牟取高額利潤(rùn)。目前，我國(guó)還沒(méi)有針對(duì)有機(jī)雞蛋、散養(yǎng)雞蛋的國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，只有一些地方性的標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，而且其重點(diǎn)是生產(chǎn)過(guò)程的監(jiān)控，缺少檢測(cè)和鑒別指標(biāo)。因此，建立不同飼養(yǎng)方式的雞蛋檢測(cè)和鑒別方法，對(duì)于打擊不法生產(chǎn)廠家，維護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益具有重大意義。

基于穩(wěn)定同位素的自然分餾特征[6-7]，穩(wěn)定同位素技術(shù)已被用于一些植源性產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源和真實(shí)性鑒別[8-12]。動(dòng)物是異養(yǎng)生物，雖然穩(wěn)定同位素在代謝過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一些代謝分餾，但動(dòng)物體內(nèi)的同位素組成一般會(huì)保留其原料的同位素差異[13-17]。文獻(xiàn)[14-16]已對(duì)牛奶、雞肉、牛肉等動(dòng)物源性食品的穩(wěn)定同位素分布規(guī)律做了相關(guān)研究，證明動(dòng)物組織的穩(wěn)定同位素分布受飼料種類(lèi)和生長(zhǎng)環(huán)境的影響，利用穩(wěn)定同位素技術(shù)可以進(jìn)行牛肉、雞肉等產(chǎn)地的溯源，和牛奶奶源的鑒別。

國(guó)際上，關(guān)于穩(wěn)定同位素在雞蛋鑒別領(lǐng)域應(yīng)用的研究和報(bào)道相對(duì)較少[18]；在國(guó)內(nèi)，穩(wěn)定同位素技術(shù)在禽蛋上的應(yīng)用基本處于空白狀態(tài)，雞蛋生產(chǎn)方式鑒別方面的研究尚處于起步階段。

本研究擬采用元素分析儀-同位素比值質(zhì)譜法(EA-IRMS)測(cè)定雞蛋各組分(蛋清、蛋黃、蛋殼膜)中δ13C和δ15N值，以及雞蛋各組分間碳氮穩(wěn)定同位素的相關(guān)性，探討不同飼養(yǎng)方式的雞蛋各組分的碳氮同位素組成，為利用碳、氮穩(wěn)定同位素鑒別蛋雞的飼養(yǎng)方式奠定基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1裝置與儀器

EA-IRMS元素分析-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo-Fisher公司產(chǎn)品，配有Flash 2000型有機(jī)元素分析儀及Conflo IV連續(xù)流稀釋裝置；烘箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)：北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品；十萬(wàn)分之一天平：瑞士Mettler-Toledo公司產(chǎn)品；分散機(jī)(型號(hào)T25)：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)材料與樣品采集

錫杯：美國(guó)Element Microanalysis公司產(chǎn)品；EA-IRMS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IAEA600(δ13CPDB=(-27.771±0.043)‰)、IAEA-CH-6(δ13CPDB=(-10.449±0.033)‰)和空氣氮庫(kù)(δ15NAir=(1.0±0.2)‰)：由國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)提供。

樣品采集地點(diǎn)：北京地區(qū)11家養(yǎng)雞場(chǎng)，其中4家散養(yǎng)雞、7家籠養(yǎng)雞；采樣時(shí)間：2015-05-01～2015-05-30；采樣方案：每隔5天隨機(jī)取1個(gè)雞蛋樣品；每家養(yǎng)雞場(chǎng)采樣量為6枚，共計(jì)66枚。11家養(yǎng)雞場(chǎng)雞的飼養(yǎng)方式及飼料組成情況列于表1。

表1　11家養(yǎng)雞場(chǎng)蛋雞的飼養(yǎng)方式及飼料組成

市場(chǎng)采樣：采集10個(gè)品牌的市售雞蛋樣品(生產(chǎn)日期為2015年5月)，其中散養(yǎng)雞蛋和非散養(yǎng)雞蛋各5個(gè)品牌。

1.3樣品前處理

1.3.1清洗用蒸餾水沖洗雞蛋，除去蛋殼表面附著的飼料、糞便等，再用丙酮擦洗蛋殼，除去蛋殼表面殘留的有機(jī)物質(zhì)，然后置于通風(fēng)櫥中揮干蛋殼表面的丙酮[19]。

1.3.2蛋清和蛋黃敲破雞蛋，分離蛋清和蛋黃，注意保證蛋黃膜的完整性，然后用移液槍吸走蛋黃周?chē)嘤嗟牡扒?，并吸除卵系帶[19]。用分散機(jī)分別均質(zhì)蛋清和蛋黃，使其組分均勻一致， 然后各取0.5 g蛋清和蛋黃，置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h后，制成均勻粉末，保存于干燥皿中，待測(cè)。

1.3.3蛋殼膜用鑷子小心分離蛋殼上所有的蛋殼膜，用蒸餾水沖洗5次，置于40 ℃烘箱中烘干1 h，然后進(jìn)行液氮研磨，制成均勻粉末，置于干燥皿中，待測(cè)。

1.4樣品測(cè)定

EA-IRMS分析系統(tǒng)[20]的條件為氧化管溫度980 ℃，還原管溫度650 ℃，柱溫60 ℃，氦氣流速100 mL/min[20]。利用跳峰模式同時(shí)測(cè)定碳、氮穩(wěn)定同位素，88 s時(shí)開(kāi)始進(jìn)樣，先用15N的測(cè)定程序，305 s時(shí)自動(dòng)調(diào)整至13C的測(cè)定程序，其色譜圖示于圖1。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，得出樣品的δ13C、δ15N值。

在樣品測(cè)定序列中，同時(shí)測(cè)定2個(gè)參考物質(zhì)，依據(jù)Stephen等[21]報(bào)道的方法進(jìn)行校正，得出樣品的δ13CPDB。

測(cè)定結(jié)果以δ(‰)表示[22]：

其中，R樣品為稀有同位素/豐富同位素的比值(例如15N/14N，或者13C/12C)；R標(biāo)準(zhǔn)為13C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，美國(guó)南卡羅來(lái)納州白堊紀(jì)皮狄組層位中的擬箭石化石(V-PDB)，13C/12C=(11 237.2±90)×10-6。

15N標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為空氣氮庫(kù)中15N與14N的比值，15N/14N=0.003 68。

圖1　碳、氮穩(wěn)定同位素同時(shí)測(cè)定色譜圖

2結(jié)果與討論

2.1測(cè)定重復(fù)性驗(yàn)證

隨機(jī)選取1枚雞蛋，按1.3節(jié)步驟處理雞蛋各組分。蛋清、蛋黃分別處理6份，蛋殼膜按1.3節(jié)方法烘干后，進(jìn)行初步破碎，按其質(zhì)量平均分成6份，分別進(jìn)行液氮研磨。每份樣品平行測(cè)定3次，其結(jié)果列于表2?？梢钥闯觯瑴y(cè)定的穩(wěn)定碳、氮同位素值具有良好的重復(fù)性，SD值不高于0.20‰，均在誤差允許范圍內(nèi)[23]。

2.2采樣穩(wěn)定性驗(yàn)證

按1.2節(jié)方法采集樣品，按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理，然后測(cè)定已收集雞蛋各組分的δ13C值和δ15N值，隨機(jī)選取的其中一家養(yǎng)雞場(chǎng)樣品的測(cè)定結(jié)果列于表3。可以看出：30天內(nèi)同一養(yǎng)雞場(chǎng)不同批次雞蛋各組分的δ13C值和δ15N值有良好的穩(wěn)定性；各組分δ13C的SD值不超過(guò)0.2‰，δ15N的SD值不超過(guò)0.3‰；比較而言，蛋清的穩(wěn)定性最為良好。其他10家樣品也得到了類(lèi)似的測(cè)定結(jié)果：同一養(yǎng)雞場(chǎng)按1.2節(jié)方法采集的雞蛋樣品各組分δ13C和δ15N的SD值均不超過(guò)0.4‰，在此不再一一羅列測(cè)定數(shù)據(jù)。該結(jié)果說(shuō)明，在飼養(yǎng)方式和飼料組成不變的情況下，一段時(shí)間內(nèi)，雞蛋各組分的穩(wěn)定同位素分布規(guī)律未呈現(xiàn)出明顯的改變，按照1.2節(jié)方法采集的樣品的碳、氮穩(wěn)定同位素分布特征可以代表該養(yǎng)雞場(chǎng)的整體情況。

表2　測(cè)定重復(fù)性驗(yàn)證

表3　采樣穩(wěn)定性驗(yàn)證

2.3雞蛋不同組分碳、氮穩(wěn)定同位素關(guān)系研究

2.3.1雞蛋各組分中碳穩(wěn)定同位素特征蛋清、蛋黃和蛋殼膜3 種組分之間的δ13C值存在差異，但也存在一定的規(guī)律。各組分δ13C值從大到小的順序依次為蛋殼膜>蛋清>蛋黃。相關(guān)性分析結(jié)果表明，三者呈兩兩正相關(guān)，其中，蛋清與蛋黃、蛋清與蛋殼膜的相關(guān)系數(shù)分別為 0.768、0.761，蛋黃與蛋殼膜的相關(guān)系數(shù)為0.640，結(jié)果示于圖2。這說(shuō)明：不同飼養(yǎng)方式的雞蛋各組分δ13C值的變化趨勢(shì)一致，這是因?yàn)榈扒?、蛋黃、蛋殼膜均來(lái)自于同一個(gè)蛋雞機(jī)體，其同位素必然有同源性[24]；但3種組分之間的δ13C值存在差異，這是因?yàn)椴煌M分的成分組成是不同的，而不同化學(xué)成分在蛋雞消化吸收、再合成過(guò)程中的代謝分餾情況不同[25]。Sakamoto等[26]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪的δ13C值低于蛋白質(zhì)的，雞蛋各組分中蛋殼膜是一種膠原蛋白，而蛋黃脂肪含量很高，所以δ13C值呈上述的變化規(guī)律。

2.3.2雞蛋各組分中氮穩(wěn)定同位素特征蛋清、蛋黃和蛋殼膜3 種組分之間的δ15N值也存在差異，各組分δ15N值從大到小的順序依次為蛋黃>蛋清>蛋殼膜，這與各組分δ13C值的變化規(guī)律相反。相關(guān)性分析結(jié)果表明，三者之間兩兩正相關(guān)，蛋清與蛋黃、蛋清與蛋殼膜的相關(guān)系數(shù)分別為0.862和0.875，蛋黃與蛋殼膜的相關(guān)系數(shù)為0.711，結(jié)果示于圖3。與碳同位素一樣，各組分的穩(wěn)定氮同位素也表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，這說(shuō)明，蛋清、蛋黃、蛋殼膜對(duì)膳食或環(huán)境中15N的累積模式相同[27]。

圖2　蛋清、蛋黃、蛋殼膜δ13C值的相關(guān)性

圖3　蛋清、蛋黃、蛋殼膜δ15N值的相關(guān)性

由于雞蛋各組分的δ13C值和δ15N值均具有相關(guān)性，且蛋殼膜分離操作困難，蛋黃脂肪含量高，較難冷凍干燥，為了實(shí)驗(yàn)方便，后續(xù)研究只取蛋清作為研究對(duì)象，僅比較不同來(lái)源雞蛋中蛋清的碳氮同位素組成。

2.4實(shí)際應(yīng)用

動(dòng)物組織中的同位素組成不僅受食物種類(lèi)的影響，而且受代謝分餾的影響。研究表明，碳同位素主要與植物的光合作用方式有關(guān)，而氮同位素受氣候、土壤、施肥、植物類(lèi)型等多種因素影響[28-29]。因此，動(dòng)物組織中的δ13C值主要反映食物組成，而δ15N值是多種因素綜合影響的結(jié)果。生態(tài)學(xué)上，經(jīng)常用15N來(lái)研究動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)等級(jí)[30]?；\養(yǎng)和散養(yǎng)蛋雞主要飼料的碳、氮穩(wěn)定同位素分布情況列于表4。

表4　蛋雞主要飼料的δ13C值和δ15N值

2.4.1由碳穩(wěn)定同位素值進(jìn)行鑒別散養(yǎng)、籠養(yǎng)兩種飼養(yǎng)方式的雞蛋蛋清的δ13C值示于圖4。可以看出，散養(yǎng)雞蛋的δ13C值在范圍上更為偏正，這可能是因?yàn)樯B(yǎng)雞食入的動(dòng)物脂肪較多，相應(yīng)的雞蛋脂肪含量高[31]，而脂肪對(duì)13C有貧化作用[32]，所以脂肪含量越高，蛋清的δ13C值越偏正。但由于這兩類(lèi)飼養(yǎng)方式的主要飼料組成都是玉米和豆粕，所以δ13C值的交疊范圍大。因此，δ13C值不能為單一樣品飼養(yǎng)方式的鑒別提供明顯有效的依據(jù)，但可作為大批量樣品鑒別的參考。

圖4　蛋清的δ13C值

2.4.2由氮穩(wěn)定同位素值進(jìn)行鑒別與籠養(yǎng)相比，散養(yǎng)的蛋雞能自由覓食，有機(jī)會(huì)攝入營(yíng)養(yǎng)等級(jí)更高的動(dòng)物蛋白，使得蛋清的δ15N值比籠養(yǎng)的雞蛋更為偏正[33]，結(jié)果示于圖5。由圖5可見(jiàn)，散養(yǎng)方式生產(chǎn)的雞蛋蛋清的δ15N值明顯高于籠養(yǎng)方式生產(chǎn)的雞蛋，這與Rogers[32]得出的結(jié)論一致。

圖5　蛋清的δ15N值

2.4.3市售商品雞蛋的驗(yàn)證分別收集5個(gè)品牌的市售散養(yǎng)雞蛋和非散養(yǎng)雞蛋，測(cè)定蛋清的δ13C值和δ15N值，分布情況示于圖6?？梢钥闯觯荷B(yǎng)和非散養(yǎng)雞蛋呈現(xiàn)明顯差異性；有一品牌標(biāo)明為純山林放養(yǎng)雞蛋，其δ15N值高達(dá)6.85‰，明顯高于其他品牌的樣品，這可能與自由覓食地域范圍大，有機(jī)會(huì)食入更多昆蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)等高級(jí)動(dòng)物蛋白有關(guān)；有一非散養(yǎng)品牌雞蛋的δ15N值為負(fù)數(shù)，這可能與該品牌雞蛋的飼料來(lái)源為重度施肥區(qū)有關(guān)；另外有一散養(yǎng)品牌雞蛋的δ15N值為1.79‰，更接近于籠養(yǎng)雞蛋，懷疑為假冒產(chǎn)品，需要通過(guò)其他研究進(jìn)一步確認(rèn)。

圖6　不同批次雞蛋蛋清的δ13C和δ15N分布圖

3結(jié)論

本工作建立了元素分析儀-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋各組分(蛋黃、蛋清、蛋殼膜)的碳、氮穩(wěn)定同位素。研究表明，雞蛋中不同組分的δ13C和δ15N之間均具有良好的相關(guān)性，可選擇其中一種組分進(jìn)行后續(xù)研究分析，而且同一養(yǎng)雞場(chǎng)30天內(nèi)生產(chǎn)的雞蛋的穩(wěn)定同位素組成波動(dòng)較小。本工作研究了散養(yǎng)雞蛋和籠養(yǎng)雞蛋的穩(wěn)定同位素特征，數(shù)據(jù)顯示，由于不同飼養(yǎng)方式飼喂的飼料種類(lèi)不同，兩種雞蛋的穩(wěn)定同位素組成存在一定的差異，其中散養(yǎng)雞蛋δ13C值較籠養(yǎng)雞蛋更為偏正，δ15N值也大于籠養(yǎng)雞蛋，這表明應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)可以區(qū)分不同飼養(yǎng)方式的雞蛋，進(jìn)而鑒別蛋雞的飼養(yǎng)方式。但是，由于穩(wěn)定同位素的自然波動(dòng)特性，同種飼料也可能出現(xiàn)同位素差異，因此，該方法的應(yīng)用準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

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收稿日期：2015-09-25;修回日期：2015-11-12

作者簡(jiǎn)介：戴祁(1991—)， 女(漢族)，甘肅人，碩士研究生，從事穩(wěn)定同位素技術(shù)研究。E-mail: d_q2012@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2997(2016)04-0366-08

doi：10.7538/zpxb.2016.37.04.0366

Study on Stable Carbon and Nitrogen Isotope Characteristics of Cage-Free Eggs and Caged Eggs

DAI Qi1,2,3, ZHONG Qi-ding2,3, WANG Dao-bing2,3, WU Zhu-ying2,3,CHEN Shan-shan2,3, XIAO Dong-guang1

(1.TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China;2.ChinaNationalInstituteofFoodandFermentationIndustries,Beijing100015,China;3.NationalStandardizationCenterofFood&FermentationIndustry,Beijing100015,China)

Abstract:A method of elemental analysis-stable isotope ratio mass spectrometry (EA-IRMS) was established for determination of the components of carbon and nitrogen stable isotope of EW (egg white), EY (egg yolks) and EM (eggshell membrane). And carbon and nitrogen stable isotope distribution characteristics of free-range eggs and caged eggs were explored preliminary. The results show that the method has good repeatability in determination of carbon and nitrogen isotopic composition of EW, EY and EM, and SD values are less than 0.2‰ (n=6). Carbon and nitrogen isotopic compositions are different in egg white, egg yolks and eggshell membrane (δ13C: EM >EY>EW, δ15N: EW>EY>EM). But δ13C values of each components are linearly related (R2 are 0.768, 0.768, 0.761 for EW, EY and EM, respectively), and δ15N values for each components also have linear relationship (R2 are 0.862, 0.862, 0.875). δ13C and δ15N values of free-range eggs (EW) are from -18.00‰ to -14.97‰ and from 3.02‰ to 4.37‰, respectively, and that of caged eggs(EW) are from -18.96‰ to -15.98‰ and from 1.66‰ to 2.68‰, respectively. Combined with δ13C and δ15N values can better distinguish caged eggs and free-range eggs.

Key words：egg; element analyzer-isotope ratio mass spectrometry (EA-IRMS); feeding pattern; identification