焦玉　　王雙艷（湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬襄陽(yáng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 襄陽(yáng) 441000）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選消脹合劑的提取工藝

焦玉王雙艷
（湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬襄陽(yáng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 襄陽(yáng) 441000）

目的：研究消脹合劑的提取工藝。方法：以提取時(shí)間、提取次數(shù)和加水量為考察因素，以柚皮苷的含量和總干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選消脹合劑的最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為A3B2C2，即煎煮2次，每次2小時(shí)，加水倍量為1∶8。結(jié)論：優(yōu)選得到的工藝穩(wěn)定、可行，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

消脹合劑；柚皮苷；正交試驗(yàn)；提取工藝

消脹方為我院普泌外科多年臨床驗(yàn)方，其處方由大黃、芒硝、枳殼、黨參、茯苓、白術(shù)、萊菔子等14味中藥組成。功效活血行氣，潤(rùn)腸通便。用于腹脹、非絞窄性腸梗阻，腸功能紊亂所致腹脹。臨床已經(jīng)完成了消脹方促進(jìn)腹部術(shù)后胃腸動(dòng)力恢復(fù)的研究［1］。結(jié)果顯示該方能明顯提前術(shù)后患者的首次排氣時(shí)間和首次排便時(shí)間?？蓪⒃擈?yàn)方結(jié)合現(xiàn)代制藥技術(shù)開(kāi)發(fā)成合劑以更好應(yīng)用于臨床。本文采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取時(shí)間、提取次數(shù)和加水量為考察因素，提取的干膏得率和處方枳殼中柚皮苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝。

1　儀器與試藥

ZF-1三用紫外分析儀（上海顧村光電儀器廠），QC2030型超聲清洗器（天津市旗美科技有限公司），P-01隔膜真空泵（天津市東康科技有限公司），高效液相色譜儀（2910泵，2930UV檢測(cè)器，N2000工作站，上海天普精密科學(xué)儀器有限公司），C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）。柚皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-200610，供含量測(cè)定用）。消脹合劑樣品（襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：20130618）。甲醇、乙腈（色譜級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取處方量藥材按照表1中的方法煎煮提取，并濃縮至200 mL。選用三因素三水平正交試驗(yàn)表L9（34），考察因素分別為提取時(shí)間、提取次數(shù)和加水倍量。

表1　提取工藝因素水平表

2.2柚皮苷含量測(cè)定方法的建立

2.2.1色譜條件C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），ODS預(yù)柱。流動(dòng)相：甲醇-冰醋酸-水（70∶3∶130），流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm。

2.2.2系統(tǒng)適用性理論塔板數(shù)按柚皮苷計(jì)算不低于3 000，拖尾因子在0.95～ 1.05之間，主峰柚皮苷與雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。

2.2.3溶液的制備

2.2.3.1對(duì)照品溶液的制備取105℃下干燥5 h以上的柚皮苷對(duì)照品適量，加70%甲醇溶解制成84 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3.2供試品溶液的制備精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加入70%甲醇至刻度，充分振搖，放置，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4專屬性試驗(yàn)按照處方量稱取缺枳殼的藥材，照“2.2.3”項(xiàng)下制備陰性樣品溶液，并按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明其他成分對(duì)柚皮苷色譜峰無(wú)干擾。樣品溶液、對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液色譜圖分別見(jiàn)圖1～ 3。

圖1　　樣品溶液色譜圖

圖2　　對(duì)照品溶液色譜圖

圖3　　陰性樣品溶液色譜圖

2.2.5方法學(xué)研究

2.2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取柚皮苷對(duì)照品10.00 mg，置50 mL量瓶中，加 70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。并以濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：

Y=1 102.7X+215.28，R2=0.999 6。結(jié)果表明，柚皮苷在20～200 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5.2精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液84 μg/mL連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，峰面積分別為143 385.703，145 673.656，141 928.594，144 015.75，143 241.094，141 485.125，平均值為143 288.320，RSD為 1.05%，表明精密度良好。

2.2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品（批號(hào)為：20130618）1份，按照“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中柚皮苷色譜峰峰面積分別為95 077.000，97 193.727，96 105.273，95 246.094，95 877.879，平均值為95 899.995，RSD為0.88%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.4重復(fù)性試驗(yàn)取同批樣品（批號(hào)為：2013 0618）6份，按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算每次測(cè)得的柚皮苷含量，分別為70.376 0，72.051 1，71.807 6，72.100 6，72.374 4，72.184 5 μg/mL，平均含量為71.815 7 μg/mL，RSD為1.02%，表明重復(fù)性良好。

2.2.5.5加樣回收率試驗(yàn)精密稱取柚皮苷對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含0.84 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密量取已知含量（895.0 μg/mL）的樣品（批號(hào)：20130618）0.5 mL，共6份，精密量取柚皮苷對(duì)照品溶液0.5 mL，按照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，并測(cè)定分析，計(jì)算回收率，分別為98.36%，97.27%，100.18%，97.71%，99.41%，95.93%。平均值為98.14%，RSD為1.56%。

2.2.5.6檢測(cè)限與定量限采用對(duì)照品濃度稀釋法，經(jīng)多次試驗(yàn)，儀器的檢測(cè)限和定量限分別為98.5 ng/mL和320 ng/mL。

2.2.6柚皮苷含量的測(cè)定將按照表1制備的樣品溶液制備成供試品溶液，再按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算柚皮苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.7干浸膏得率的測(cè)定精密吸取提取液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，于105℃干燥5 h，移至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，按下式計(jì)算干浸膏得率：

干浸膏得率（%）=干浸膏總量（g）/藥材總量（g）×100%。

表2　　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表2中極差的大小，各因素對(duì)提取的影響程度依次為A＞C＞D＞B，表3中方差分析結(jié)果表明，因素A對(duì)提取有顯著性影響。根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果，其最佳提取工藝為A3B2C2，即煎煮2次，每次2小時(shí)，加水倍量為1∶8。

表3　　方差分析結(jié)果

2.2.9驗(yàn)證試驗(yàn)取同一批藥材，稱取處方量，按照A3B2C2的提取工藝驗(yàn)證 3批，測(cè)得柚皮苷的含量分別為375.68，381.56，382.45 mg，干浸膏量分別為 20.13%，20.87%，20.93%，與正交優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果一致。說(shuō)明正交試驗(yàn)優(yōu)選出的工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。

3　討論

3.1含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

處方中君藥為大黃，大黃的主要成分為蒽醌類化合物，其飲片和復(fù)方制劑的定量分析中多采用大黃素、大黃酚等多指標(biāo)同時(shí)定量［2］，在建立該制劑的質(zhì)量控制方法時(shí)，本研究采用甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行色譜分離，發(fā)現(xiàn)分離度和柱效不甚理想。方中枳殼為臣藥，功效理氣寬中，行滯消脹。枳殼的有效成分主要為揮發(fā)油、黃酮類等。該藥主要藥理作用為胃腸道作用、抗腸痙攣、抗?jié)?、利膽溶石等?］，與處方功效一致。其黃酮類化合物主要含柚皮苷。柚皮苷含量測(cè)定現(xiàn)多采用高效液相色譜法。因此本工藝篩選研究選擇采用高效液相色譜法測(cè)定枳殼中的柚皮苷。

3.2色譜條件的選擇

3.2.1流動(dòng)相的選擇本試驗(yàn)考察了以下4種流動(dòng)相：《中國(guó)藥典》2010年版一部枳殼“含量測(cè)定”項(xiàng)下流動(dòng)相乙腈-水（20∶80）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3），乙腈-水（25∶75）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3），甲醇-冰醋酸-水（70∶3∶130），發(fā)現(xiàn)采用甲醇-冰醋酸-水（70∶3∶130）時(shí)柱效高，分離度和拖尾因子均符合要求，因此最終選擇采用甲醇-冰醋酸-水（70∶3∶130）作為柚皮苷含量測(cè)定的流動(dòng)相。

3.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取含量測(cè)定項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法在200～ 400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，樣品在283 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，因此將含量測(cè)定波長(zhǎng)暫定為283 nm。

3.2.3提取溶劑的選擇根據(jù)指標(biāo)性成分柚皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)，屬于二氫黃酮類化合物，極性較大。因此考察30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇和流動(dòng)相6種溶劑。按照供試品溶液的制備和色譜條件平行操作并進(jìn)樣分析，其峰面積分別為92 262.203，103 084.297，105 631.117，56 551.102，84 255.703，78 389.898，表明70%甲醇提取柚皮苷峰面積最大。因此供試品溶液選擇70%甲醇提取。

［1]蔡志強(qiáng)，段雅斌，劉錦華，等.消脹合劑促進(jìn)急性化膿性闌尾炎術(shù)后胃腸功能恢復(fù)臨床觀察［J］.河南中醫(yī)，2013，33（1）：86-87.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［3］宿樹(shù)蘭.枳殼的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2001，24（3）：222-224.

Optimization of Extraction Procedure for Xiaozhang Mixture by Orthogonal Design

Jiao Yu，Wang Shuangyan（Department of Pharmacy of Xiangyang Hospital Affiliated to Hubei University of Chinese Medicine，Hubei Xiangyang 441000，China）

Objective：To optimize the extraction procedure for Xiaozhang mixture.Methods：The time duration for extraction，times of boiling and amount of added water in extraction procedure for Xiaozhang mixture were optimized，using the content of naringin and the yield of total dry extract as indicators for evaluation.Results：The optimal extraction procedure was as follows；boil for 2 times，2 hours for each，and the ratio of the drug material and water was 1∶8.Conclusion：The optimized procedure is stable and feasible，which may be used for industrial production.

Xiaozhang Mixture；Naringin；Orthogonal Test；Extraction Procedure

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.01.007

焦玉，女，碩士，主管藥師。主要從事院內(nèi)新制劑注冊(cè)申報(bào)和藥品檢驗(yàn)工作。通訊作者 E-mail：jiaoyu1216@163.com

2015-08-18）