蕭俊祺　　彭偉文　　董旺鳳　　李圣鵬（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

復(fù)方黑面神軟膏處方提取工藝研究

蕭俊祺彭偉文董旺鳳李圣鵬
（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

目的：建立復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素和苦參堿含量的測(cè)定方法，優(yōu)化提取工藝條件。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定表兒茶素和苦參堿含量，并運(yùn)用正交試驗(yàn)考察浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)苦參含量的影響。結(jié)果：表兒茶素在0.008 4～ 0.033 6 g/L內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：y=13 346x+ 11.632，r=1.000 0。最佳水提工藝：藥材加20倍量水浸泡45 min，80℃溫浸提取2次，每次1 h?？鄥A在0.029 4～ 0.588 g/L線性關(guān)系良好，回歸方程：y=1 714.9x-3.835 5，r=0.999 9，平均回收率達(dá)96.7%，RSD為 1.18%。煎煮最佳工藝條件：藥材加20倍水浸泡45 min，提取兩次，每次1 h。結(jié)論：HPLC測(cè)定復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素和苦參堿的含量操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，可用于復(fù)方黑面神軟膏的質(zhì)量控制。

復(fù)方黑面神軟膏；苦參堿；正交試驗(yàn)；高效液相色譜法

黑面神為大戟科植物黑面神（Breynia fruticosa （L.）Hook.f.）的干燥全株，具有清濕熱、化瘀滯的功效，用于濕疹、皮膚瘙癢、過(guò)敏性皮炎、漆過(guò)敏、陰道炎、外陰瘙癢、帶狀皰疹等多種疾病的治療［1］。彭偉文等［2］在黑面神的藥理作用上作了研究，驗(yàn)證了其有抗炎作用、免疫抑制作用、抗皮膚Ⅰ型超敏反應(yīng)作用。針對(duì)黑面神在上述疾病方面的獨(dú)特療效，擬研制出以黑面神為主藥，苦參為臣藥，蛇床子、白鮮皮和地膚子為佐藥的外用制劑復(fù)方黑面神軟膏。

王英晶等［3］通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）對(duì)黑面神枝葉中表兒茶素含量進(jìn)行了測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上運(yùn)用HPLC測(cè)定復(fù)方黑面神軟膏君藥黑面神中表兒茶素和臣藥苦參中苦參堿的含量，并運(yùn)用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，為 HPLC測(cè)定黑面神復(fù)方制劑的含量奠定基礎(chǔ)。

1　儀器和試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 1100 series）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ3200E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪華中儀器廠）；東方-A型直熱式電熱恒溫干燥箱（廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）。

1.2試藥

黑面神（廣州至信藥業(yè)有限公司），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定教研室鑒定為大戟科黑面神屬植物（Breynia fruticosa（L.）Hook.f.）；苦參（廣州至信藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140601）；蛇床子（廣州至信藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150101）；地膚子（亳州市毫廣中藥飲片有限公司，批號(hào)：20120722）；白鮮皮（廣州至信藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140601）；表兒茶素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110878-200102）；苦參堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110805-200508）。水為屈臣氏蒸餾水；甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.1.1色譜條件色譜柱為Boston Green ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，采用梯度洗脫，其程序見(jiàn)表1。流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為：表兒茶素 280 nm，苦參堿220 nm，進(jìn)樣量為20 μL。理論塔板數(shù)按表兒茶素計(jì)算不低于3 600，按苦參堿計(jì)算不低于4 000。根據(jù)以上條件，表兒茶素和苦參堿的保留時(shí)間分別為48.333 min和10.026 min。色譜圖見(jiàn)圖1～ 4。

圖1　　表兒茶素對(duì)照品溶液HPLC圖

圖2　　表兒茶素供試品溶液HPLC圖

圖3　　苦參堿對(duì)照品溶液HPLC圖

圖4　　苦參堿供試品溶液HPLC圖

2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取表兒茶素對(duì)照品8.4 mg，加50%甲醇制成每1 mL含0.84 mg的溶液，搖勻，得表兒茶素對(duì)照品溶液；精密稱取苦參堿對(duì)照品 14.7 mg，加甲醇制成每 1 mL含1.47 mg的溶液，搖勻，得苦參堿對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備取黑面神藥材30 g加20倍量水浸泡45 min，80℃溫浸提取2次，每次1 h，過(guò)濾得藥渣，濾液70℃減壓濃縮到一定量，用50%甲醇定容至50 mL，得表兒茶素供試品溶液。藥渣和剩余的4味藥（苦參15 g，白鮮皮10 g，蛇床子8 g，地膚子5 g）加20倍量水浸泡45 min，提取2次，每次1 h，提取液過(guò)濾，濃縮至一定濃度，加95%乙醇沉淀至70%濃度，4℃放置一夜，抽濾，濾液回收乙醇，用甲醇定容至50 mL，得苦參堿供試品溶液。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取“2.1.2”中表兒茶素和苦參堿對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mL置5 mL量瓶中，表兒茶素用50%甲醇稀釋至刻度，苦參堿用甲醇稀釋至刻度，在“2.1.1”條件下進(jìn)樣20 μL。以進(jìn)樣濃度（g/L）為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，表兒茶素回歸方程為：

y=13 346x+11.632（r=1.000 0），

線性范圍：0.008 4～ 0.033 6 g/L?？鄥A回歸方程為：

y=1 714.9x-3.835 5（r=0.999 9），

線性范圍：0.029 4～ 0.588 0 g/L。

2.1.5精密度試驗(yàn)分別精密吸取同一濃度的表兒茶素對(duì)照品溶液和苦參堿對(duì)照品溶液，在“2.1.1”條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得表兒茶素含量和苦參堿含量，結(jié)果顯示表兒茶素含量RSD=1.85%，苦參堿含量RSD=1.17%。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)取6份30 g黑面神，按表兒茶素供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理。另取黑面神藥渣，苦參15 g，白鮮皮10 g，蛇床子8 g，地膚子5 g，共6份，按苦參堿供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，在“2.1.1”條件下進(jìn)樣分析，分別測(cè)得表兒茶素含量和苦參堿含量，結(jié)果顯示表兒茶素含量RSD=0.95%，苦參堿含量RSD=1.39%。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取黑面神按表兒茶素供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，另取黑面神藥渣，苦參，白鮮皮，蛇床子和地膚子，按苦參堿供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，分別于0，2，4，8，16，24 h在“2.1.1”條件下進(jìn)樣分析，分別測(cè)得表兒茶素含量和苦參堿含量，結(jié)果顯示表兒茶素含量RSD= 1.43%，苦參堿含量 RSD=0.96%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8回收率試驗(yàn)分別按表兒茶素供試品溶液和苦參堿供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理后的樣品平均各分為6份，平行分2組，分別精密加入表兒茶素對(duì)照品0.350 mg和0.715 mg，苦參堿對(duì)照品0.350 mg和0.715 mg，按各自供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，在“2.1.1”條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示表兒茶素平均回收率達(dá)98.2%，RSD=0.75%。苦參堿平均回收率達(dá)97.5%，RSD=0.67%，表明表兒茶素和苦參堿加樣回收率試驗(yàn)良好，符合定量分析要求。結(jié)果見(jiàn)表2～ 3。

表2　　表兒茶素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3　　苦參堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2正交試驗(yàn)

2.2.1表兒茶素提取正交試驗(yàn)

2.2.1.1水提工藝條件為優(yōu)選出黑面神的最佳提取工藝，以表兒茶素為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)浸泡時(shí)間，加水量，提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行考察（表4）。

表4　　表二茶素正交試驗(yàn)因素和水平

2.2.1.2表兒茶素正交樣品溶液的制備取黑面神 30 g置1 000 mL燒杯中，按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行提取，具體工藝流程如下：黑面神→加水浸泡→80℃浸泡→過(guò)濾→水提液→減壓濃縮→定容至50 mL→得9份樣品溶液。在“2.1.1”條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定表兒茶素含量，結(jié)果見(jiàn)表5～ 6。

2.2.1.3試驗(yàn)結(jié)果分析從直觀分析結(jié)果可知，影響表兒茶素含量高低的各考察因素次序?yàn)镈＞A＞C＞B，方差分析結(jié)果顯示，浸泡時(shí)間、加水量和提取時(shí)間對(duì)表兒茶素含量的影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05），提取次數(shù)對(duì)表兒茶素含量的影響有顯著性差異（P=0.031＜0.05）。綜合考慮各影響因素，最終確定優(yōu)選的提取工藝條件為A2B1C2D2，即 30 g黑面神加 20倍量水浸泡 45 min，80℃溫浸提取2次，每次1 h。

表5　　正交試驗(yàn)結(jié)果

表6　　表兒茶素方差分析結(jié)果

2.2.2苦參堿提取正交試驗(yàn)

2.2.2.1水提工藝條件為優(yōu)選出苦參的最佳提取工藝，以苦參堿的含量和干膏率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì) L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行考察，其程序見(jiàn)表7。

表7　　苦參堿正交試驗(yàn)因素和水平

2.2.2.2苦參堿正交樣品溶液的制備取黑面神藥渣、15 g苦參、10 g白鮮皮、8 g蛇床子和 5 g地膚子置1 000 mL燒杯中，按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行提取，具體工藝流程如下：

原處方藥材→加水浸泡→煎煮→過(guò)濾→水提液→濃縮至一定體積→醇沉→靜置一夜→抽濾→濾液回收乙醇→濃縮→定容至50 mL→得9份樣品溶液。在“2.1.1”條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定苦參堿含量，結(jié)果見(jiàn)表8～ 9。

2.2.2.3干膏得率的測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2010年版一部（附錄ⅩA）浸出物測(cè)定法［4］，將正交試驗(yàn)所得的藥液濃縮至10 mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿（設(shè)質(zhì)量為W1）中，水浴揮干，殘?jiān)?05℃干燥 3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量（設(shè)質(zhì)量為W2），通過(guò)以下公式計(jì)算干膏得率：

結(jié)果見(jiàn)表8和表10。

表8　　正交試驗(yàn)結(jié)果

表10　　苦參堿含量方差分析結(jié)果

2.2.2.4試驗(yàn)結(jié)果分析從直觀分析結(jié)果可知，各考察因素對(duì)干膏得率的影響次序?yàn)锽＞D＞C＞A（表10），對(duì)苦參堿含量的影響次序?yàn)镃＞B＞D＞A（表9），綜合評(píng)分影響提取效率的因素次序?yàn)镈＞B＞C＞A（表8和表11）。由方差分析結(jié)果可知，加水量和提取次數(shù)對(duì)苦參堿含量的影響有顯著性差異（P=0.041＜ 0.05，P=0.036＜0.05），浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)苦參堿含量的影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。通過(guò)綜合考慮，確定優(yōu)選提取工藝條件為A2B3C2D2，即黑面神藥渣、苦參、白鮮皮、蛇床子和地膚子加20倍量水浸泡45 min，煎煮提取2次，每次1 h。

表9　　干膏得率方差分析結(jié)果

表11　　綜合評(píng)分方差分析結(jié)果

3　小結(jié)與討論

表兒茶素有一定的熱不穩(wěn)定性，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究，從黑面神中提取表兒茶素時(shí)采用80℃溫浸提取法提取得到的表兒茶素含量最高，在本次實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。預(yù)實(shí)驗(yàn)還比較了溫浸提取法，醇提水沉法和水提醇沉法對(duì)苦參中苦參堿含量的影響。結(jié)果顯示，水提醇沉法苦參堿得率較溫浸法高。故選擇溫浸提取為表兒茶素的提取方法，水提醇沉法提取作為苦參堿的提取方法。為體現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)研究復(fù)方劑型的性質(zhì)，每次提取苦參堿時(shí)加入溫浸提取后的黑面神藥渣。因用甲醇定容制得的表兒茶素供試品所測(cè)得的峰面積過(guò)小，而用50%甲醇定容制得的表兒茶素供試品測(cè)得的峰面積較大且分離度較好，故制備表兒茶素對(duì)照品溶液和供試品溶液時(shí)用50%甲醇定容。

《中國(guó)藥典》2010年版記載測(cè)定苦參堿含量時(shí)，色譜柱填充劑為氨基鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10），檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。在此條件下進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)苦參堿在2 min左右出峰，拖尾嚴(yán)重且峰形較差。究其原因可能是本次實(shí)驗(yàn)使用C18色譜柱而不是氨基鍵合硅膠色譜柱。此條件下表兒茶素沒(méi)有明顯峰形。在檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，選用流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，苦參堿出峰時(shí)間為10.02 min，分離度明顯改善但仍有拖尾。表兒茶素出峰時(shí)間為48.333 min，峰形較好。當(dāng)波長(zhǎng)改為220 nm，在此梯度洗脫條件下，苦參堿峰形得到進(jìn)一步改善，但表兒茶素峰形不如在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)到的。故表兒茶素選用280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，苦參堿選用220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相均為甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫。

近年來(lái)對(duì)黑面神藥理作用及臨床應(yīng)用的研究報(bào)道日益增多，但在黑面神復(fù)方制劑研究方面進(jìn)展緩慢，尤其是在國(guó)內(nèi)。研究黑面神，既可為黑面神屬植物化學(xué)成分的分類奠定基礎(chǔ)，也可為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)黑面神復(fù)方制劑奠定基礎(chǔ)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為黑面神及其復(fù)方制劑的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1]《廣東中藥志》編輯委員會(huì).廣東中藥志（第一卷）［M］.廣州：廣東科技出版社，1990：362.

［2］彭偉文，譚泳怡，梅全喜，等.黑面神水提物抗炎作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.今日藥學(xué)，2012，22（3）：145-147.

［3］王英晶，彭偉文，梅全喜，等.黑面神枝葉中表兒茶素的含量測(cè)定及水提工藝優(yōu)化［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（9）：93-95.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

Procedure for Extraction of Compound Breynia Fruticosa Ointment

Xiao Junqi，Peng Weiwen，Dong Wangfeng，Li Shengpeng（Zhongshan Traditional Chinese Medical Hospital Affiliated to Guangzhou Univeristy of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Zhongshan 528400，China）

Objective：To develop a method for determination of epicatechin and matrine contents in compound breynia fruticosa ointment and optimize theprocedure for extraction.Methods：The epicatechin and matrine contents were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.The effects of time for immersing，ratio of solid to liquid as well as time duration for extraction and number of extraction cycle on the matrine content were evaluated by orthogonal test.Results：The linear range of epicatechin was 0.008 4～ 0.033 6 g/L，of which the regression equation of standard curve was as fbllows：y=13 346x+11.632，r=1.000 0.The optimal water extraction procedure was as fb1lows：the materials were immersed with water at 20 times of the volume for 45 min，and extracted at 80℃ for 2 times，1 h for each.The linear range of atrine was 0.029 4～ 0.588 g/L，while the regression equation was as follows：y=1 714.9x-3.835 5，r=0.999 9.The mean recovery ofmatrine was 96.7%，with a RSD of 1.18%.The optimal condition for decoction extraction was as fo1lows：the materials were immersed with water at 20 times of the volume for 45 min and extracted for 2 times，1 h for each. Conclusion：HPLC method for determination of matrine is simple，specific，accurate and reliable，which may be used for quality control of compound breynia fruticosa ointnent.

Compound Breynia Fruticosa Ointnent；Matrine；Orthogonal Test；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.01.004

廣東省中山市科技局項(xiàng)目（20102A033）

蕭俊祺，男，藥師。主要從事中藥制劑開(kāi)發(fā)與研究。E-mail：602045059@qq.com
彭偉文，男，主任中藥師，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事中藥制劑開(kāi)發(fā)與研究。通訊作者E-mail：pww200688@21cn.com

2015-08-12）