盧天蘭伍智镠阮燕燕賈美香岳偉華李俊王力芳張岱

孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系染色體核型分析研究☆

盧天蘭*※伍智镠*※阮燕燕*賈美香*岳偉華*李俊*王力芳*張岱*

目的 分析中國漢族人群孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系的染色體核型特征，并篩查染色體畸變，探討患者染色體畸變區(qū)域是否存在拷貝數(shù)變異和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因，為尋找孤獨(dú)癥譜系障礙的遺傳病因提供線索。方法 采用G帶顯色技術(shù)并依據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）對632個(gè)孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系（包括632例患者及其健康生物學(xué)父母1264名）進(jìn)行染色體核型分析，并根據(jù)各染色體帶型特征篩查染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變情況。經(jīng)與細(xì)胞遺傳學(xué)芯片標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)盟（International Standards for Cytogenomic Arrays，ISCA）數(shù)據(jù)庫和人類亞微觀結(jié)構(gòu)基因組變異和疾病表型數(shù)據(jù)庫（Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resource，DECIPHER）比對，探討檢出的染色體畸變區(qū)域是否可能存在與孤獨(dú)癥譜系障礙和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的致病性拷貝數(shù)變異和基因。結(jié)果 共檢出攜帶染色體畸變的患者22例，占患者3.48%（22/632）。其中5例為新生畸變，在患者中檢出率為0.79%（5/632），包括1例重復(fù)，1例平衡易位，2例Turner綜合征核型，1例21q22區(qū)域額外未知來源片段；另外17例染色體畸變?yōu)楦改高z傳，占患者2.69%（17/632）。經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，檢出的染色體1q25和3p24畸變區(qū)域可能存在致病性較高的拷貝數(shù)變異，并累及TNR、ASTN1、NMNAT2等神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因。結(jié)論 部分孤獨(dú)癥譜系障礙患者存在新生染色體畸變；染色體畸變區(qū)域可能存在累及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)致病基因的拷貝數(shù)變異。染色體核型分析可為尋找孤獨(dú)癥譜系障礙的遺傳病因提供線索。

孤獨(dú)癥 核型分析 染色體畸變

【Abstract】Objective To detect chromosomal aberrations of autism spectrum disorder（ASD），we performed karyotypes analyses in 632 ASD trios and then investigated whether copy number variants and neurodevelopment related genes are present in the regions of chromosomal aberrations.Methods Karyotypes analyses were performed in 632 ASD trios （1896 individuals）.In addition，we investigated whether there were pathogenic copy number variants located in the relevant regions of detected aberrant karyotypes by using the database of the International Standards for Cytogenomic Arrays （ISCA）and the Genomic Variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources（DECIPHER）for ASD patients. Results We detected aberrant results in 22 of 632 patients（3.48%）by karyotypes analyses.Of these 22 aberrant karyotypes，5 were de novo（0.79%），including the duplication，the translocation，karyotypes of Turner syndrome and the additional material with unknown origin.Seventeen children affected with autism had aberrant karyotypes inherited from oneof their parents.By using the ISCA and the DECIPHER database，we found that several copy number variants with high pathogenicity were located in 1q25 and 3p24.Further，these copy number variants consisted of several genes related to neurodevelopment such asTNR，ASTN1，andNMNAT2.Conclusion There are a few de novo chromosomal aberrations in some patients affected with ASD.Copy number variants of several pathogenic neurodevelopmental related genes may exist in the regions of chromosomal aberrations.Karyotypes analyses may be applied to explore the genetic etiology in some patients affected with ASD.

【Key words】Autism Karyotyping Chromosomal aberrations

孤獨(dú)癥譜系障礙是一組嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育疾病，遺傳因素在其發(fā)病中具有重要作用［1-3］。染色體是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體，核型分析有助于發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異。國外細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明孤獨(dú)癥譜系障礙患者存在染色體結(jié)構(gòu)變異［3-4］。孤獨(dú)癥譜系障礙患者中發(fā)生平衡性染色體重排和不平衡性染色體結(jié)構(gòu)變異（如缺失、重復(fù)）的概率分別為5%和2%～6%［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)染色體畸變區(qū)域可能存在累及神經(jīng)精神障礙和腦發(fā)育相關(guān)基因的拷貝數(shù)變異［5］。目前我國尚缺少大樣本的孤獨(dú)癥譜系障礙染色體核型數(shù)據(jù)，尤其缺乏孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系的染色體核型分析，導(dǎo)致不能篩查患者新生染色體畸變。故本研究對632個(gè)孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系進(jìn)行染色體核型分析，繼而探討染色體畸變區(qū)域是否可能存在致病性拷貝數(shù)變異并累及基因。

1　對象與方法

1.1研究對象 招募自2009年1月1日至2014年12月31日于北京大學(xué)第六醫(yī)院診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙的患者及其健康生物學(xué)父母?；颊呷虢M標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤18歲，漢族；②符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，F(xiàn)ourth Edition，DSM-Ⅳ）孤獨(dú)癥、阿斯伯格綜合征（Asperger syndrome）或未特定廣泛性發(fā)育障礙（pervasive developmental disorder-not otherwise specified，PDD-NOS）的診斷標(biāo)準(zhǔn)，由2名兒童精神科主任醫(yī)師進(jìn)行診斷；②孤獨(dú)癥患者兒童孤獨(dú)癥評定量表（childhood autism rating scale，CARS）＞36分；③孤獨(dú)癥患者孤獨(dú)癥行為量表（autism behavior checklist，ABC）≥53分?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：①患有苯丙酮尿癥、脆性X染色體綜合征或結(jié)節(jié)性硬化；②患有其他嚴(yán)重軀體疾病；③通過2名兒童精神科主任醫(yī)師詳細(xì)詢問生長發(fā)育史和精神檢查等，診斷合并符合DSM-Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)的其他軸Ⅰ精神障礙?；颊吒改溉虢M標(biāo)準(zhǔn)：①患者生物學(xué)父親與母親，漢族；②無精神障礙和嚴(yán)重軀體疾病病史；③無家族性遺傳病史。本研究由北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對象均詳細(xì)了解本研究的目的和內(nèi)容，并簽署知情同意書；孤獨(dú)癥譜系障礙患兒由其法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 所有研究對象于晨起抽取外周靜脈血5 mL于肝素抗凝的離心管中。之后將抗凝全血0.3 mL接種到1640混合培養(yǎng)基（北京易市盛達(dá)科技發(fā)展有限公司），37℃培養(yǎng)72 h。于70 h加入秋水仙素，作用2 h后收獲細(xì)胞。

1.2.2染色體標(biāo)本制備將培養(yǎng)物移入離心管，離心后棄去上清，加入低滲液，37℃水浴28 min；加少量固定液后用吸管吹勻，再次離心。棄掉上清液，加入固定液5～6 mL，固定15 min，2500 r/min離心10 min，去掉上清液，再次加入固定液，用吸管吹勻后離心。棄掉上清后則制成合適的外周血淋巴細(xì)胞懸液。

1.2.3染色體G顯帶處理 細(xì)胞懸液加入幾滴固定液后滴片。每份樣本滴片2張，滴片后自然干燥，次日70℃烤片3 h。用0.2%的胰酶/生理鹽水處理滴好的載玻片15 s，生理鹽水涮洗兩次，Giemsa工作液扣染20 min后，沖洗去除多余染液，室溫下晾干，以確保標(biāo)本經(jīng)染液充分顯色。顯色后的染色體在光鏡下可呈現(xiàn)明暗相間的帶紋，即為染色體帶型。鏡下觀察染色體帶型是否清晰。

1.2.4核型分析 顯帶處理好的載玻片在Olympus BX-51顯微鏡放大倍數(shù)1000倍下觀察清晰的染色體中期分裂相，應(yīng)用Applied Imaging（AI）公司細(xì)胞遺傳學(xué)工作站進(jìn)行圖像采集，并依據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）進(jìn)行核型分析。鏡下觀察染色體的數(shù)目是否存在單體、缺體、三體和多體等情況；與正常標(biāo)準(zhǔn)的染色體帶紋進(jìn)行比較，觀察各染色體特征性的帶型是否發(fā)生變化，是否存在缺失、重復(fù)、倒位、易位，有無等臂染色體、環(huán)狀染色體等染色體結(jié)構(gòu)畸變。人工判讀染色體核型，由另一人進(jìn)行審核后確定染色體核型分析結(jié)果。

1.2.5數(shù)據(jù)庫比對染色體畸變區(qū)域的致病性拷貝數(shù)變異及基因 細(xì)胞遺傳學(xué)芯片標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)盟（International Standards for Cytogenomic Arrays，ISCA）數(shù)據(jù)庫由臨床細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)共同構(gòu)建，包括大量不明原因的發(fā)育遲緩（unexplained developmental delay）、孤獨(dú)癥（autism）、智力障礙（intelligence disability）和其他發(fā)育障礙（other developmental disorders）兒童的細(xì)胞遺傳學(xué)芯片檢測結(jié)果。人類亞微觀結(jié)構(gòu)基因組變異和疾病表型數(shù)據(jù)庫（Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resource，DECIPHER）包含多種疾病患者的拷貝數(shù)變異信息，其中孤獨(dú)癥患者1084例。ISCA和DECIPHER數(shù)據(jù)庫的芯片結(jié)果在錄入之前，均依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)指南［6］，評估染色體指定區(qū)域累及的拷貝數(shù)變異是否具有致病效應(yīng)。應(yīng)用ISCA和DECIPHER數(shù)據(jù)庫，以“孤獨(dú)癥”或“孤獨(dú)癥譜系障礙”作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將本研究檢出的染色體畸變區(qū)域與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，分析可能累及的拷貝數(shù)變異及基因。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與分析。Kolmogorov-Smirnov（K-S）單樣本檢驗(yàn)示患者及其父母年齡為非正態(tài)分布，采用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）［M（QL，QU）］進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；各類染色體畸變核型占患者總?cè)藬?shù)的比例采用構(gòu)成比（%）描述。

2　結(jié)果

2.1研究對象一般情況 本研究共納入632個(gè)中國漢族孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系，包括632例患者及其健康生物學(xué)父母1264名，共1896人?；颊咧心行?54例，女性78例，年齡中位數(shù)4.83（3.50，7.00）歲；孤獨(dú)癥624例，阿斯伯格綜合征1例，未特定的廣泛性發(fā)育障礙7例。健康生物學(xué)父母共1264名，父親年齡中位數(shù)34.00（32.00，37.00）歲，母親年齡中位數(shù)32.00（30.00，35.00）歲。

2.2孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系染色體核型分析結(jié)果 632例孤獨(dú)癥譜系障礙患者中，共發(fā)現(xiàn)染色體畸變22例，占3.48%（22/632），其中男性18例，女性4例。有染色體畸變患者中5例為新生的染色體畸變，占患者0.79%（5/632），其中男性1例，女性4例；包括1例重復(fù)（46，XX，dup（1）（q25；q31），1例平衡易位（46，XX，t（5；18）（p10；q10），2例Turner綜合征核型（mos45，X［73］/46，X，i（X）（q10）［27］；46，X，i（X）（q10），以及1例21q22區(qū)域額外未知來源片段，即發(fā)現(xiàn)21q22有一增加片段，但無法判斷該片段的來源（46，XY，add（21）（q22）。見表1。其余17例染色體畸變均為父母遺傳，占患者2.69%（17/632），9例為父親遺傳，8例為母親遺傳。遺傳的染色體畸變中，9號染色體臂間倒位共13例，包括12例46，XY，inv（9）（p13；q12）和1例46，XY，inv（9）（p21；q21）。見表2。

表1 5例新生染色體畸變患者信息

2.3檢出染色體畸變區(qū)域的致病性拷貝數(shù)變異比對結(jié)果 經(jīng)與ISCA和DECIPHER數(shù)據(jù)庫比對，本研究檢出的染色體畸變區(qū)域存在致病性拷貝數(shù)變異共12例，其中缺失拷貝數(shù)5例，重復(fù)拷貝數(shù)7例。見表3與表4。DECIPHER數(shù)據(jù)庫提示，1q25、3p24區(qū)域可能存在致病性較高的拷貝數(shù)變異，且累及與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元活動(dòng)相關(guān)的基因，如TNR、ASTN1、NMNAT2和KCNH8等基因。見表3。染色體9p12、9q13區(qū)域在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中均未發(fā)現(xiàn)致病性的拷貝數(shù)變異。

表2 22例染色體畸變核型分析結(jié)果

表3檢出染色體畸變區(qū)域可能累及的致病性拷貝數(shù)變異及基因

3　討論

本研究采用家系設(shè)計(jì)，篩查孤獨(dú)癥譜系障礙患者新生染色體畸變，有助于尋找孤獨(dú)癥譜系障礙的遺傳病因［4，6］。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶新生染色體畸變的患者占患者0.79%（5/632），與SHEN等［7］報(bào)道的0.94%（8/852）基本一致。而攜帶染色體畸變的患者占患者總?cè)藬?shù)3.48%（22/632），稍高于SHEN等［7］2.23%（19/852）的結(jié)果，原因可能與種族差異及不同研究的抽樣誤差不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的5例新生染色體畸變中，Turner綜合征核型在既往研究中曾有報(bào)道［2］，另外3例（46，XX，dup（1）（q25；q31）；46，XX，t（5；18）（p10；q10）；46，XY，add（21）（q22）既往研究未曾報(bào)道。此3例新生染色體畸變區(qū)域累及部分與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因，如TNR（1q25）、NMNAT2（1q25）和DYRK1A（21q22.13）基因［8-10］。另有研究發(fā)現(xiàn)DYRK1A基因的新生突變與孤獨(dú)癥有關(guān)［11］，提示新生染色體畸變可能是部分患者的致病原因，并且TABET等［4］在孤獨(dú)癥譜系障礙患者新生的平衡性染色體重排中，發(fā)現(xiàn)斷裂點(diǎn)位置拷貝數(shù)變異累及參與突觸形成的EPB41L3基因，而突觸形成參與建立的神經(jīng)環(huán)路在孤獨(dú)癥譜系障礙的致病機(jī)制中有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)Turner綜合征核型攜帶者具有孤獨(dú)癥譜系障礙的臨床表型，與既往研究結(jié)果一致［2，12］，提示臨床工作中應(yīng)考慮女性孤獨(dú)癥譜系障礙患者攜帶此類核型的可能性，通過核型分析可進(jìn)一步明確診斷。本研究發(fā)現(xiàn)9號染色體的臂間倒位占所有染色體畸變的半數(shù)以上，且均為父母遺傳，而父母無孤獨(dú)癥譜系障礙的臨床表型。SHEN等［7］的研究也曾報(bào)道此類核型，提示9號染色體臂間倒位可能是一種在人群中廣泛存在的染色體結(jié)構(gòu)變異。此外，有研究報(bào)道高加索人群中的孤獨(dú)癥患者存在15q11-q13區(qū)域的重復(fù)［3，5］，但本研究未發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的重復(fù)，提示不同種族患者畸變區(qū)域和致病原因可能存在差異。

表4檢出染色體畸變區(qū)域累及致病性拷貝數(shù)變異

經(jīng)與數(shù)據(jù)庫比對，本研究中部分染色體畸變區(qū)域（如1q25和3p24.3）可能存在與孤獨(dú)癥譜系障礙相關(guān)的致病性拷貝數(shù)變異和基因。位于染色體1q25區(qū)域的部分受累基因與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，如ASTN1基因和TNR基因在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)并且影響神經(jīng)元的遷移與分化［8，13］；NMNAT2基因則參與神經(jīng)元軸突的生長［9］。一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究提示位于3p24.3的ZNF385D基因與語言受損、閱讀困難等疾病癥狀相關(guān)［14］。另外，位于該區(qū)域的KCNH8基因可能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放及神經(jīng)元興奮性［15］。以上結(jié)果提示部分染色體畸變區(qū)域累及與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因，可能與孤獨(dú)癥譜系障礙有關(guān)。

綜上所述，本研究對632個(gè)孤獨(dú)癥譜系障礙核心家系（共1896人）進(jìn)行染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)部分患者存在新生的染色體畸變，且部分畸變區(qū)域累及拷貝數(shù)變異和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因。染色體核型分析有助于尋找孤獨(dú)癥譜系障礙的部分遺傳病因。本研究尚有不足之處，如未能深入分析染色體畸變區(qū)域累及拷貝數(shù)變異和基因。今后將進(jìn)一步探索基因組水平上的亞顯微結(jié)構(gòu)變化，為孤獨(dú)癥譜系障礙的分子遺傳學(xué)研究提供新線索。

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（責(zé)任編輯：肖雅妮）

Karyotypes analyses in 632 autism spectrum disorder trios.

LU Tianlan，WU Zhiliu，RUAN Yanyan，JIA Meixi-ang，YUE Weihua，LI Jun，WANG Lifang，ZHANG Dai.Institute of Mental Health，The Sixth Hospital，Peking University；Key Laboratory of Mental Health，Ministry of Health&National Clinical Research Center for Mental Disorders（Peking University），Beijing 100191，China.Tel：010-82801960.

R749.94

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.03.005
☆國家自然科學(xué)基金（編號：81471383）；首都臨床特色應(yīng)用研究專項(xiàng)（編號：Z131107002213100）
*北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所，北京大學(xué)第六醫(yī)院，衛(wèi)生部精神衛(wèi)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京大學(xué)），國家精神心理疾病臨床研究中心（北京 100191）
※共同第一作者

（E-mail：lifangwang@bjmu.edu.cn；junli1985@bjmu.edu.cn）

2015-11-22）