高　寒，武榮國，王書紅，張思佳，年　麗，鄔　迪，崔繼文

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

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應(yīng)用電化學(xué)微檢測系統(tǒng)檢測細(xì)胞中嘌呤堿基①

高寒，武榮國，王書紅，張思佳，年麗，鄔迪，崔繼文

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

摘要：目的：構(gòu)建電化學(xué)微檢測系統(tǒng)，在電化學(xué)檢測中節(jié)省細(xì)胞樣品，提高檢測效率。方法：以三電極工作系統(tǒng)為基礎(chǔ)，在工作電極上套上微管作為微型反應(yīng)池，倒置后加入微量待測試溶液，將參比電極和對電極放入溶液中，形成穩(wěn)定的微反應(yīng)系統(tǒng)，得到更穩(wěn)定、更強(qiáng)的電化學(xué)信號。結(jié)果：僅僅30μL MCF-7細(xì)胞即在電化學(xué)微檢測系統(tǒng)中出現(xiàn)兩個氧化峰，分別歸因于黃嘌呤/鳥嘌呤和腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化還原反應(yīng)。結(jié)論：MCF-7細(xì)胞中的嘌呤堿基在電化學(xué)微檢測系統(tǒng)中具有較好的電化學(xué)響應(yīng)，該電化學(xué)法有可能用于細(xì)胞內(nèi)嘌呤的檢測。

關(guān)鍵詞：MCF-7；微檢測系統(tǒng)；MWCNTs-IL/GCE；單線掃描伏安法

近年研究表明細(xì)胞內(nèi)嘌呤堿基具有電化學(xué)活性，采用循環(huán)伏安法測試能夠得到較好的電化學(xué)信號，但基于傳統(tǒng)三電極工作系統(tǒng)的電化學(xué)檢測中細(xì)胞樣本消耗較大，導(dǎo)致檢測成本升高，從而限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[1～9]；如果能夠改進(jìn)檢測體系，降低細(xì)胞樣本消耗量，又能得到足夠的電化學(xué)響應(yīng)，可以有效評價細(xì)胞活性，將對細(xì)胞電化學(xué)進(jìn)一步的應(yīng)用具有極為重要的意義，故本文以人乳腺腫瘤細(xì)胞(MCF-7)為模型細(xì)胞，在原三電極體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一下巧妙的改裝，設(shè)計了一種相對比較簡便、快捷并且十分廉價的微檢測體系，來研究細(xì)胞內(nèi)嘌呤堿基的電化學(xué)行為，為拓展細(xì)胞電化學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域提供實踐基礎(chǔ)。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；HH.CP-T型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；人乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7，東北林業(yè)大學(xué)贈送；次黃嘌呤，黃嘌呤，鳥嘌呤，腺嘌呤，Sigma公司；多壁碳納米管(MWCNTs)，深圳納米港有限公司；離子液體(IL)，J&K Chemical Ltd.；優(yōu)級胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、雙抗(鏈霉素和青霉素)，Gibco公司；其余試劑均為分析純。

1.2電化學(xué)微檢測系統(tǒng)的建立

本實驗通過大膽的構(gòu)想，設(shè)計一種相對比較簡便、快捷并且十分廉價的微電極體系：在原三電極體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一下巧妙的改裝，把一個與工作電極粗細(xì)相當(dāng)?shù)乃芰瞎芴自诠ぷ麟姌O上，然后將工作電極倒立，以玻碳電極的鏡面作為反應(yīng)池的底，塑料管作為反應(yīng)池的側(cè)壁，用移液槍往反應(yīng)池中打入待測液，再把參比電極和對電極插入到液面下，即得電化學(xué)微檢測系統(tǒng)，該體系僅需30μL待測液即可完成一次電化學(xué)檢測。

1.3電化學(xué)檢測

本實驗分別采用電化學(xué)微檢測系統(tǒng)和常規(guī)三電極體系完成電化學(xué)測試，其中多壁碳納米管和離子液體復(fù)合修飾玻碳電極(MWCNTs-IL/GCE)為工作電極，Ag/AgCl絲為參比電極，Pt絲為輔助電極，采用單線掃描伏安法進(jìn)行檢測，伏安掃描范圍為0.0～+1.0V，掃速為0.05 V·s-1，通常掃描兩次，一般情況采集第一次的數(shù)據(jù)。除特殊說明外，測定均在室溫條件下進(jìn)行，測定前需要在電位+0.0V下富集360 s。每次電化學(xué)測定結(jié)束后，MWCNTs-IL/GCE均在pH 7.4 PBS溶液中循環(huán)伏安掃描5圈，重新得到穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好的更新電極。

1.4MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

MCF-7細(xì)胞放在DMEM培養(yǎng)液中，于37℃恒溫、5% CO2、100% 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至在培養(yǎng)皿中80%貼壁時，用適量的0.25%胰蛋白酶消化，放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中消化至胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，加適量DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

將生長狀態(tài)良好且長滿培養(yǎng)皿底的細(xì)胞依次按0.25% 胰蛋白酶消化、吹打懸浮、離心(1000 r·min-1，10min)后得細(xì)胞沉淀，所得細(xì)胞沉淀用pH 7.4 PBS溶液沖洗3次，然后用適量的pH 7.4 PBS溶液配成細(xì)胞懸液并計數(shù)，取一部分細(xì)胞懸液在50℃水浴鍋中加熱30min后得到MCF-7細(xì)胞裂解液用于電化學(xué)測定。

1.5高效液相(HPLC)檢測

將不同濃度細(xì)胞裂解液和4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品混合物進(jìn)行HPLC檢測，進(jìn)樣量均為為20μL，色譜條件：Ascenis RP-Amide柱(250mm×4.0mm ID，5.0μm)，DAD檢測器，檢測波長為254nm，流動相為磷酸二氫鉀溶液，pH 4.0，流速為1.0mL·min-1。

2結(jié)果與討論

2.1電化學(xué)微檢測系統(tǒng)和常規(guī)三電極體系對比

圖1是濃度均為5×10-6mol·L-1的次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤的混合溶液的單線掃描伏安圖，在電化學(xué)微檢測系統(tǒng)和常規(guī)三電極體系中檢測均得到兩個電化學(xué)信號，分別在0.5936V和0.9216V左右出現(xiàn)兩個信號，前一個信號為鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化還原峰，后一個信號為腺嘌呤和次黃嘌呤的氧化還原峰，對比圖1a和1b可知，電化學(xué)微檢測系統(tǒng)檢測得到的峰電流變得更強(qiáng)，以上檢測結(jié)果表明電化學(xué)微檢測系統(tǒng)在消耗較少待測液的情況下，還可以得到較強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)信號，如果應(yīng)用于細(xì)胞電化學(xué)檢測則可以有效節(jié)省細(xì)胞樣品，提高檢測效率，因此本實驗所建立的電化學(xué)微檢測系統(tǒng)具有很高的應(yīng)用價值。

圖1　電化學(xué)微檢測系統(tǒng)和常規(guī)三電極體系對比

2.2MCF-7細(xì)胞在微反應(yīng)電極系統(tǒng)上的電化學(xué)行為

MCF-7細(xì)胞裂解液在電化學(xué)微檢測系統(tǒng)和常規(guī)三電極體系中的電化學(xué)行為如圖2所示，MCF-7細(xì)胞裂解液在常規(guī)三電極體系中僅在0.5941V處出現(xiàn)一個信號，歸屬于鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化還原峰，而在電化學(xué)微檢測系統(tǒng)中則分別在0.6230V和0.9587V處出現(xiàn)兩個明顯的電化學(xué)信號，分別歸屬于鳥嘌呤/黃嘌呤和 腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化還原峰[9]，這個結(jié)果表明電化學(xué)微檢測系統(tǒng)的電化學(xué)檢測敏感性要遠(yuǎn)高于常規(guī)三電極體系，把它應(yīng)用到細(xì)胞活性與抗癌藥物敏感性，將可以節(jié)省大量細(xì)胞樣品，從而降低檢測費用，為細(xì)胞電化學(xué)用于臨床檢測奠定一定的基礎(chǔ)。

圖2　MCF-7細(xì)胞裂解液的單線掃描伏安圖

2.3高效液相檢測

本實驗采用高效液相色譜法對細(xì)胞中嘌呤類物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示，通過四種混合標(biāo)準(zhǔn)品得到了四個分離良好的液相峰(圖3A)，保留時間分別為：12.53，13.63，15.65，21.41min，依次為次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤，說明四種嘌呤類物質(zhì)能夠很好的分離。圖3B為MCF-7細(xì)胞的不同濃度的色譜圖，得到了7個分離良好的色譜峰，其中能確定的四個色譜峰：12.68，13.78，15.88，21.53min與標(biāo)準(zhǔn)品圖中次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤的峰位一致，說明MCF-7細(xì)胞也存在次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤，由此可以證明把電化學(xué)方法檢測的兩個信號歸因于四種嘌呤的氧化還原是正確的。

圖3　不同濃度細(xì)胞和四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

(A)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品混合物；(B)細(xì)胞裂解液(HX：次黃嘌呤，G：鳥嘌呤，X：黃嘌呤，A：腺嘌呤；a：1×106cells mL-1b：7×105cells mL-1c：3×105cells mL-1d：8×104cells mL-1)

3討論

我們采用工作電極上套上微管作為微型反應(yīng)池，并把參比電極和對電極集成在一起構(gòu)建了電化學(xué)微檢測系統(tǒng)，僅僅消耗30μL MCF-7細(xì)胞樣本即在電化學(xué)微檢測系統(tǒng)中得到分別歸屬于黃嘌呤/鳥嘌呤和腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化還原峰，結(jié)果表明MCF-7細(xì)胞中的嘌呤堿基在電化學(xué)微檢測系統(tǒng)中具有較好的電化學(xué)響應(yīng)，該電化學(xué)法有可能用于細(xì)胞內(nèi)嘌呤的檢測。

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基金項目：①1.國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目，編號：201310222002；2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)面上項目，編號：L2014-004；3.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)面上項目，編號：L2012-054。

作者簡介：高寒(1992～)女，山東濟(jì)寧人，在校本科學(xué)生。 通訊作者：崔繼文(1967～)男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：cjwhljjms@163.com。

中圖分類號：R965.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0099-02

(收稿日期：2016-04-04)