張淼，王文君，祝鵬宇，郭穎，李書霖（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 5000；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 50040；.黑龍江省中醫(yī)藥管理局，哈爾濱 50090）

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·動物實(shí)驗(yàn)·

針刺內(nèi)關(guān)穴對心肌肥厚小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

張淼1，王文君2，祝鵬宇1，郭穎1，李書霖3
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫(yī)藥管理局，哈爾濱 150090）

【摘要】目的觀察針刺內(nèi)關(guān)穴對小鼠心肌肥厚狀態(tài)的影響。方法將36只健康C57BL6小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和治療組，每組12只。治療組針刺內(nèi)關(guān)穴，每日1次，每次留針15 min。治療9 d后，比較各組心臟重量/脛骨長度值的變化。對各組小鼠左心室心肌組織行Masson三原染色法，采用普通光學(xué)顯微鏡在100倍視野下觀察各組心肌纖維排列及膠原纖維分布的差異。并用透射電子顯微鏡觀察受損心肌組織肌節(jié)結(jié)構(gòu)，肌原纖維排列，膠原纖維及線粒體等超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果與空白組比較，模型組心率顯著增快，治療組心率顯著降低。模型組和治療組心臟重量、心臟重量/脛骨長度比值均較空白組顯著增加（P ＜0.01）；治療組心臟重量、心臟重量/脛骨長度比值均較模型組顯著降低（P＜0.01）。模型組心肌組織出現(xiàn)代償性肥大且呈現(xiàn)不連續(xù)狀態(tài)，少數(shù)心肌橫紋出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂/斷裂，核固縮及胞漿嗜酸性變明顯；治療組優(yōu)于模型組。模型組部分肌原纖維灶性融合，間質(zhì)膠原纖維增生，線粒體腫脹及代償性增多，治療組優(yōu)于模型組。結(jié)論針刺內(nèi)關(guān)穴能夠減少膠原纖維及線粒體等的產(chǎn)生，整合肌節(jié)結(jié)構(gòu)排列，延緩心肌肥厚的進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】針刺療法；穴，內(nèi)關(guān)；心肌肥厚；超微結(jié)構(gòu)；小鼠

慢性心力衰竭（CHF）是由于各種增加心臟負(fù)荷的因素誘發(fā)心室重構(gòu)，導(dǎo)致心臟泵血功能障礙而引起的病理疾患［1］，機(jī)理復(fù)雜且持續(xù)進(jìn)展加重。心功能因各種誘因受損早期，心肌收縮力逐漸減弱，為保證心臟正常的血液輸出，機(jī)體補(bǔ)充建立以心肌肥厚為主的代償機(jī)制［2］。代償以心肌纖維增生為主，伴隨線粒體增大和變多，為克服心臟壓力負(fù)荷，需維持相當(dāng)?shù)男呐叛恐敝潦Т鷥敗?/p>

近年來炎癥和心肌肥厚的關(guān)系受到研究者們的廣泛關(guān)注，微炎癥作為一種低強(qiáng)度、慢性進(jìn)展的非顯性炎癥狀態(tài)，貫穿了心肌代償?shù)恼麄€過程，是心肌肥厚進(jìn)展加重進(jìn)入失代償階段的重要因素［3］。炎性狀態(tài)對心肌影響除部分炎癥因子增多外，主要見于心肌間質(zhì)水腫，炎細(xì)胞浸潤及肌纖維變性、壞死，后期顯示炎細(xì)胞浸潤減少消失，間質(zhì)有明顯灶性病理改變。針灸特定穴已被眾多實(shí)驗(yàn)證明對于調(diào)節(jié)改善炎性狀態(tài)有較好的作用［4］，而針刺對于心肌肥厚的影響作為針灸抗炎理論的一種具體探索方向值得研究。本實(shí)驗(yàn)觀察針刺內(nèi)關(guān)穴對心肌肥厚小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

C57BL6小鼠36只，雄性，6～8周，體重為20～25 g，清潔級［SCXK（吉）-2013-0005］，動物喂養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸實(shí)驗(yàn)室，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期后實(shí)驗(yàn)。

鹽酸異丙腎上腺素注射液（ISO），Masson染色試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

36只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和治療組，每組12只。治療組針刺內(nèi)關(guān)穴（參照《實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜》結(jié)合人體穴位定位），留針15 min，期間每5 min輕微捻轉(zhuǎn)針1次，30 min后腹腔注射 ISO（15 mg/kg）。每日1次，共治療9 d。正常組注射等量生理鹽水，持續(xù)9 d。模型組每日注射ISO（15 mg/kg），持續(xù)9 d［5］。

1.4觀察指標(biāo)

治療完成后描記小鼠心電，電子天平稱重，3%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉后斷頸，參照小鼠立體定位圖譜取材，記錄心臟重量，游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量脛骨長度（后肢內(nèi)踝下緣至脛骨平臺），計(jì)算心臟質(zhì)量/脛骨長度。切下左心室心肌組織按試劑盒步驟說明行MASSON染色［6］。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，倍數(shù)選取100倍來觀察各組鏡下結(jié)構(gòu)的差異。左心室區(qū)仔細(xì)切取1 mm× 3 mm×1 mm心肌組織3～4塊，制作超薄切片置FEI/ Philips TCNAI G2型透射電子顯微鏡下觀察、拍片，每個標(biāo)本拍片3～5張（放大11500倍）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)和方差的齊性檢驗(yàn)后便可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA檢驗(yàn)）和t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠心率（HR）的變化

如表3所示，PP注塑件氣味在第20天的時候強(qiáng)度降低，之后穩(wěn)定在2.5級，主要是由于殘存在PP注塑件表面的小分子物質(zhì)隨著時間延長逐步揮發(fā)，之后與空氣中的小分子達(dá)成平衡，在沒有高溫的作用下，趨于穩(wěn)定狀態(tài)。如圖2所示，隨著時間的延長，甲醛、乙醛含量逐步降低，在15～20 d的時候，殘留在PP注塑件表面的醛類物質(zhì)隨空氣流通揮發(fā)，然后是熱氧化降解的醛類物質(zhì)隨著時間的延長慢慢釋放，直至檢測不到。所以，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，PP注塑件放置20 d，氣味、VOC可以達(dá)到一個較好的狀態(tài)。

由圖1可見，各組小鼠心率差別明顯，相較于空白組，模型組心率增快，治療組心率降低。

圖1　各組小鼠心率

2.2各組小鼠心臟質(zhì)量、脛骨長度比較

由表1可見，模型組和治療組小鼠心臟重量及心臟重量/脛骨長度比值與空白組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組小鼠心臟重量及心臟重量/脛骨長度比值與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示動物模型的建立是比較成功的，針刺內(nèi)關(guān)穴可以使小鼠心臟重量及心臟重量/脛骨長度比值降低，其數(shù)值較模型組有顯著性差異，證明治療方法是有效的。

表1　各組小鼠心臟質(zhì)量、脛骨長度比較?。ā纒）

表1　各組小鼠心臟質(zhì)量、脛骨長度比較?。ā纒）

注：與空白組比較1）P＜0.01；與模型組比較2）P＜0.01

組別　n　心臟重量（mg）　脛骨長度（mm）　心臟重量/脛骨長度（mg/mm）空白組　12　119.17±9.96　17.23±1.38　6.93±0.48模型組　12　146.67±14.971）　16.42±0.77　8.93±0.781）治療組　12　138.72±18.441）2）　17.87±2.23　7.76±0.611）2）

2.3各組光鏡下MASSON染色心肌纖維化比較

為區(qū)別于HE染色，鏡下組織間質(zhì)充斥的膠原纖維被染為藍(lán)色?？瞻捉M顯示心肌纖維排列整齊，形態(tài)完整，胞漿豐富，胞核飽滿。細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核位于肌纖維中央，心肌間質(zhì)和心肌未見異常。心肌細(xì)胞的縱切面橫紋清晰，細(xì)胞核居中，少量血管及結(jié)締組織分布。橫切面為不規(guī)則的多角形，核周圍可見點(diǎn)狀放射狀排列的肌原纖維。相比于空白組，模型組心肌組織出現(xiàn)代償性肥大且呈現(xiàn)不連續(xù)狀態(tài)，心肌細(xì)胞炎性浸潤明顯，間質(zhì)密布藍(lán)色膠原纖維，少數(shù)心肌橫紋出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂/斷裂，核固縮及胞漿嗜酸性變明顯。治療組與模型組比較，心肌細(xì)胞間質(zhì)藍(lán)色膠原纖維減少，細(xì)胞紊亂明顯減輕。詳見圖2。

2.4各組電鏡下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較

空白組基本結(jié)構(gòu)清晰，肌原纖維排列規(guī)則，可見成排線粒體分布于肌原纖維間，內(nèi)外膜完整，嵴清晰。模型組線粒體內(nèi)外膜不清晰，部分線粒體嵴絮狀變性，肌節(jié)明暗帶部分融合消失，部分肌原纖維灶性融合，間質(zhì)膠原纖維增生，線粒體發(fā)生腫脹及代償性增多。治療組肌節(jié)結(jié)構(gòu)尚可，肌原纖維未見損傷，少量線粒體腫脹，漿細(xì)胞不明顯。詳見圖3。

圖2　各組光鏡下MASSON染色心肌組織結(jié)構(gòu)（×100）

圖3　各組電鏡下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×11500）

3　討論

心肌肥厚屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”范疇，《普濟(jì)方·針灸》：“穴內(nèi)關(guān)主心中憒憒。”《圣濟(jì)總錄》：“內(nèi)關(guān)，系于心包絡(luò)，心系實(shí)則心痛，虛則為煩?！薄队颀埥?jīng)》：“陰維為病苦心痛。”《二十八難》：“陰維，起于諸陰交也，維絡(luò)諸陰脈會于任脈?！敝T經(jīng)行于胸腹脅肋，其循行主治與《醫(yī)宗金鑒》相印證，即內(nèi)關(guān)穴主治氣塊上攻心胸，脅肋疼痛。

在脊神經(jīng)節(jié)的外周部位，心臟及心神經(jīng)的內(nèi)臟傳入纖維與內(nèi)關(guān)區(qū)的傳入神經(jīng)纖維有2～3個節(jié)段的重疊，而以Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ為主的脊髓各板層又交匯于中樞部位［7-8］，理論上針刺內(nèi)關(guān)穴處的神經(jīng)纖維可引起心臟區(qū)的神經(jīng)調(diào)節(jié)，對心肌細(xì)胞的異常狀態(tài)產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。連接內(nèi)關(guān)的纖維可以經(jīng)由迷走神經(jīng)節(jié)和脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元傳導(dǎo)信號到達(dá)連接心臟的神經(jīng)纖維，而迷走神經(jīng)可能作為一個重要環(huán)節(jié)參與針刺對肥大心肌產(chǎn)生的一系列影響。

ISO作用于心臟β1受體，使心收縮力增強(qiáng)，傳導(dǎo)加速。小鼠注射異丙腎上腺素后，心輸出量和心肌耗氧量增加，心率增快，表現(xiàn)為模型組小鼠心率明顯高于空白組。針刺通過抑制前額葉內(nèi)側(cè)區(qū)對自主神經(jīng)系統(tǒng)起調(diào)節(jié)作用，可增加副交感神經(jīng)活性，降低交感神經(jīng)活性，且副交感神經(jīng)的活性與針刺得氣的程度呈正相關(guān)［9］。因此，治療組小鼠心率相比模型組呈明顯下降趨勢。

機(jī)體因生長產(chǎn)生的體重波動，使得用體重作為衡量正常心臟重量的參考值具有不可靠性。比較體重作為標(biāo)準(zhǔn)，以往的研究數(shù)據(jù)顯示更同意通過脛骨長度估算心臟重量，這使我們能夠排除縱向生長的因素干擾［10］。心肌代償性肥大導(dǎo)致心臟重量呈現(xiàn)上升趨勢，同時實(shí)驗(yàn)因素對于各組間小鼠脛骨長度影響有限，使得結(jié)果中模型狀態(tài)小鼠系數(shù)值顯著高于正常狀態(tài)。

心肌組織鏡下以炎性浸潤及纖維化為主要表現(xiàn)，組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加、過量沉積且分布雜亂，是由冠狀動脈粥樣硬化性狹窄狀態(tài)引起的心肌缺血缺氧所導(dǎo)致［11］，伴鄰近心肌纖維增粗或萎縮，可能源于后負(fù)荷增加導(dǎo)致冠脈動脈內(nèi)皮產(chǎn)生缺陷，易受內(nèi)部血液流動沖擊的影響，破壞膠原分泌的平衡［12］。在冠脈周圍，AngⅡ的活性及其表達(dá)均高于其他部位［13］，可以激活心肌成纖維細(xì)胞合成大量的膠原纖維。心肌缺血缺氧等因素引起的心臟異常重構(gòu)過程中，組織細(xì)胞的損傷可導(dǎo)致機(jī)體的免疫-炎癥反應(yīng)，相關(guān)分子物質(zhì)受到刺激激活釋放到細(xì)胞間質(zhì)或血液中，鏡下可表現(xiàn)出明顯炎性浸潤。

超微結(jié)構(gòu)下，心肌組織肌節(jié)結(jié)構(gòu)的紊亂是心臟功能出現(xiàn)異常的直接原因。心肌肥厚代償過程中肌節(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯異常，肌節(jié)明暗帶隨之消失，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，通常伴隨線粒體數(shù)量和體積的變化。線粒體一方面通過ATP合成參與能量供應(yīng)，一方面也進(jìn)一步對細(xì)胞凋亡形成調(diào)控機(jī)制［14］。利用ISO誘導(dǎo)心肌肥厚模型的損傷機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，打亂線粒體能量代謝、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)紊亂和誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步凋亡等導(dǎo)致心肌細(xì)胞病理改變［15］。心力衰竭發(fā)生時將導(dǎo)致氧氣和能量供應(yīng)下降［16-19］，機(jī)體產(chǎn)生反饋性病理刺激，導(dǎo)致出現(xiàn)離子水平異常和線粒體腫脹明顯，內(nèi)膜和嵴斷裂或缺損，嵴排列不規(guī)則。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組小鼠治療后心率及心臟重量/脛骨長度比值較模型組顯著降低，光鏡鏡下膠原纖維分布較模型組減少，炎性浸潤改善；超微結(jié)構(gòu)顯示肌節(jié)排列結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于模型組，內(nèi)外膜基本完整，僅部分線粒體腫脹。研究從形態(tài)學(xué)證實(shí)了針刺內(nèi)關(guān)穴能夠改善異丙腎上腺素造成的心肌細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞內(nèi)外的炎性狀態(tài)，對心臟有一定的保護(hù)作用。而針刺過程中涉及的具體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)方式尚待進(jìn)一步研究。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0588

文章編號：1005-0957（2016）05-0588-04

收稿日期2016-01-22

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H201315）；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2013RFQYJ076）

作者簡介：張淼（1973-），女，教授，碩士生導(dǎo)師

通信作者：李書霖（1973-），男，博士生

Effect of Acupuncture at Point Neiguan on Myocardial Ultramicrostructure in Myocardial Hypertrophy Mice

ZHANG Miao1，WANG Wen-jun2，ZHU Peng-yu1，GUO Ying1，LI Shu-lin3.
1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Harbin 150001，China；2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China；3.Heilongjiang Province Administration of Traditional Chinese Medicine

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture at point Neiguan on mouse myocardial hypertrophy.Methods Thirty-sixty healthy C57BL6 mice were randomized into blank，model and treatment groups，12 rats each.In the treatment group，an acupuncture needle was inserted into point Neiguan and retained for 15 min，once daily.After nine days of treatment，the ratios of cardiac weight/tibial length were compared between the groups.Left ventricular myocardial tissues were processed by Masson trichrome staining in every group of mice.The differences in myocardial fiber arrangement and collagen fiber distribution between the groups were observed under the ordinary optical microscope in 100 times of field of vision.Sarcomere structure，myofibril arrangement，collagen fibers and mitochondria in injured myocardial tissues were observed by transmission electron microscopy. ResultsHeart rate increased significantly in the model group and decreased significantly in the acupuncture group compared with the blank group.Cardiac weight and the ratios of cardiac weight/tibial length increased significantly in the model and acupuncture groups compared with the blank group（P＜0.01）and decreased significantly in the acupuncture group compared with the model group（P＜0.01）.In the model group，myocardial tissues had compensatory hypertrophy with incontinuous status，and myocardial transverse striations had severe disorder/disruption，karyopyknosis appeared and cytoplasmic eosinophilic change became obvious in few of the rats.The results were better in the acupuncture group than in the model group.In the model group，part of myofibrils had focal fusion，interstitial collagen fibers proliferated and mitochondria had swelling and compensatory increase.The results were also better in the acupuncture group than in the model group.ConclusionsAcupuncture at point Neiguan can reduce the production of collagen fibers and mitochondria，improve the arrangement of sarcomere structure and delay the progression of myocardial hypertrophy.

［Key words］Acupuncture therapy；Point，Neiguan；Myocardial hypertrophy；Ultramicrostructure；Rats