王繼成　杜麗　秦丹卿

?

α珠蛋白基因新突變復(fù)合α地中海貧血家系的基因分析及產(chǎn)前診斷

王繼成杜麗秦丹卿

511442 廣州，廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心 婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(王繼成)

【摘要】目的對(duì)一個(gè)α珠蛋白基因新突變復(fù)合α地中海貧血的家系進(jìn)行基因分析和產(chǎn)前診斷。方法采集家系成員的外周血標(biāo)本進(jìn)行血紅蛋白毛細(xì)管電泳和紅細(xì)胞參數(shù)的分析，應(yīng)用gap-PCR、PCR-RDB和DNA測序方法對(duì)外周血和絨毛標(biāo)本DNA進(jìn)行α珠蛋白基因的鑒定。結(jié)果檢測到的α珠蛋白基因基因型為母親--/αCSα突變，父親--/αα復(fù)合HbA2:c.52G>T(p.Val17Phe)突變,絨毛標(biāo)本提示胎兒的基因型為αCSα/αα復(fù)合HbA2:c.52G>T突變。 結(jié)論HbA2:c.52G>T是一種至今國內(nèi)外未曾報(bào)道的新突變,而由其導(dǎo)致的異常血紅蛋白可加重地中海貧血的臨床癥狀。

【關(guān)鍵詞】α-地中海貧血；點(diǎn)突變；α珠蛋白基因

血紅蛋白病是全世界最常見的遺傳性血液病，可分為地中海貧血(地貧)和異常血紅蛋白。前者是由于珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白肽鏈的合成減少，而后者表現(xiàn)為珠蛋白的結(jié)構(gòu)異常。因?yàn)槎鄶?shù)已發(fā)現(xiàn)的異常血紅蛋白沒有明顯的臨床癥狀，當(dāng)常規(guī)地貧基因檢測出陽性結(jié)果時(shí)，由點(diǎn)突變引起的血紅蛋白病常被忽視[1]。HbVar數(shù)據(jù)庫(http://globin.cse.psu.edu)顯示目前全世界已發(fā)現(xiàn)超過700多種α珠蛋白基因的變異體，多數(shù)發(fā)生在α2珠蛋白基因上[2-3]。本研究發(fā)現(xiàn)一種新的α珠蛋白基因突變，并對(duì)其進(jìn)行了臨床分析和產(chǎn)前診斷，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、 研究對(duì)象

家系中的孕婦，27歲，停經(jīng)12周，血常規(guī)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素中度貧血，曾行脾臟介入栓塞術(shù)。外院常規(guī)地貧基因檢測顯示為--/αCSα中間型地貧。孕婦的丈夫，27歲，血常規(guī)提示為小細(xì)胞低色素輕度貧血。本院常規(guī)地貧基因檢測顯示為--/αα輕型地貧，血紅蛋白電泳顯示HbA2 0.8%、HbH 8.2%。包括血常規(guī)在內(nèi)的血液學(xué)結(jié)果與常規(guī)基因檢測結(jié)果不符，擬診斷其丈夫?yàn)橹虚g型α地貧。

二、 方法

使用邁瑞2000血液分析儀對(duì)外周血進(jìn)行紅細(xì)胞參數(shù)分析。應(yīng)用快速電泳分析系統(tǒng)(法國sebia capillary2)對(duì)外周血進(jìn)行血紅蛋白分析。采用亞能生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒對(duì)外周血和絨毛標(biāo)本進(jìn)行三種最常見的缺失型α地貧(--SEA/、-α4.2、-α3.7)和三種最常見的點(diǎn)突變型α地貧(HbCS、HbWS、HbQS)以及17種β地貧的基因檢測。設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增α1和α2珠蛋白基因，PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基生物有限公司進(jìn)行雙向測序。引物序列如下：HbA1 5’-TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3’和5’-TCCATCCCCTCCTCCCGCCCCTGCCTTTTC-3’，HbA2 5’-GATGGGCGGGAGTGGAGT-3’和5’-GGACAGGGGATGGTTCAGC-3’，產(chǎn)物大小分別為1 181 bp和1 241 bp。

結(jié)果

一、 血液學(xué)結(jié)果

家系成員的血液學(xué)分析結(jié)果見表1。

二、 分子診斷結(jié)果

常規(guī)地貧基因檢測和α珠蛋白基因測序的結(jié)果為檢測到母親的α珠蛋白基因基因型為--/αCSα突變，父親為--/αα復(fù)合HbA2:c.52G>T(p.Val17Phe)突變,絨毛標(biāo)本提示胎兒的基因型為αCSα/αα復(fù)合HbA2:c.52G>T突變。父親與胎兒α2珠蛋白突變的測序圖見圖1A、B。

表1　家系成員的血液學(xué)參數(shù)和基因結(jié)果

圖1　父親與胎兒α2珠蛋白突變的測序圖

A：父親的HbA2:c.52G>T純合突變測序圖；B：胎兒的HbA2:c.52G>T雜合突變測序圖

討論

我國的廣東、廣西等華南地區(qū)是異常血紅蛋白發(fā)生率較高的地區(qū)，北方地區(qū)的發(fā)生率明顯低于南方。其發(fā)病率及突變類型在不同地區(qū)、不同種族的分布具有差異性[4-6]。能引起明顯珠蛋白功能改變的異常血紅蛋白包括地中海貧血樣變異、溶血性異常血紅蛋白和氧親和力異常性異常血紅蛋白病。這些異常血紅蛋白可以在單獨(dú)存在或復(fù)合地中海貧血時(shí)，表現(xiàn)為中間型或重型地中海貧血[7]。異常血紅蛋白的傳統(tǒng)鑒定傳統(tǒng)方法采用的是珠蛋白肽鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)分析的方法，目前常用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析血紅蛋白[8-9]。本研究中采用的sebia capillary 2方法進(jìn)行血紅蛋白分析并未發(fā)現(xiàn)特異性的異常血紅蛋白。

據(jù)我們所知，HbA2: c.52G>T(p.Val17Phe)突變是一種至今國內(nèi)外未曾報(bào)道的新突變。這種突變使α2珠蛋白基因第52位密碼子由GTC變成TTC,導(dǎo)致纈氨酸替換為苯丙氨酸。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其空間結(jié)構(gòu)，而空間結(jié)構(gòu)與蛋白的功能和穩(wěn)定性相關(guān)。查詢HbVar數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，已報(bào)道的HbA2:c.53T>A(p. Val17Asp)突變與本研究報(bào)道的突變位于同一編碼子，均引起編碼氨基酸的改變。53T>A在雜合突變的情況下，顯示正常的臨床表現(xiàn)，這與52G>T的突變引起的珠蛋白的功能或穩(wěn)定性的改變可能是不同的。因?yàn)楸狙芯恐械母赣H的血液學(xué)表現(xiàn)明顯與單純的東南亞缺失型α地貧不同，表現(xiàn)為中間型α地貧。當(dāng)然本突變是否會(huì)引起珠蛋白功能和穩(wěn)定性的改變，需要進(jìn)一步在功能學(xué)上進(jìn)行鑒定。

非缺失型α地中海貧血患者的血液學(xué)表現(xiàn)不同于缺失型患者，貧血更為嚴(yán)重[10-11]。依據(jù)胎兒的基因型，我們推測胎兒是輕度至中度的地貧。因?yàn)镃S突變和新發(fā)現(xiàn)的突變均累及功能較強(qiáng)的α2基因，CS產(chǎn)生的異常肽鏈對(duì)紅細(xì)胞也有較強(qiáng)的破壞作用而引起慢性溶血性貧血[12]。從優(yōu)生遺傳的角度來看，此基因型的胎兒是這對(duì)夫婦可以擁有的臨床表型最輕的α地貧后代，所以我們建議謹(jǐn)慎考慮和選擇胎兒的去留。當(dāng)然在遺傳咨詢中，對(duì)于此類基因型需加以解釋說明其表型的多樣性。

總之，HbA2:c.52G>T是一種新發(fā)現(xiàn)的突變，這豐富了血紅蛋白變異體的數(shù)據(jù)庫。對(duì)這種突變的詳細(xì)的基因分析和臨床癥狀的描述有賴于我們今后進(jìn)行進(jìn)一步的血紅蛋白功能學(xué)的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]曾溢滔.人類血紅蛋白.北京：科學(xué)出版社，2002:150-175.

[2]Hardison RC, Chui DH, Giardine B, Riemer C, Patrinos GP, Anagnou N, Miller W, Wajcman H. HbVar: a relational database of human hemoglobin variants and thalassemia mutations of the globin gene server. Hum Mutat，2002,19(3):225-233.

[3]Giardine B, Borg J, Viennas E, Pavlidis C, Moradkhani K, Joly P, Bartsakoulia M, Riemer C, Miller W, Tzimas G, Wajcman H, Hardison RC, Patrinos GP. Updates of the HbVar database of human hemoglobin variants and thalassemia mutations. Nucleic Acids Res，2014，42(Database issue):D1063-D1069.

[4]秦良誼.我國異常血紅蛋白發(fā)生率、分布及遺傳多態(tài)性.醫(yī)學(xué)研究通訊，2003，32(12):12-14.

[5]Lou JW, Wang T, Liu YH, He Y, Zhong BM, Liu JX, Zhao Y, Ye WL, Li DZ. Prevalence and molecular characterization of structural hemoglobin variants in the Dongguan region of Guangdong province, southern China. Hemoglobin，2014，38(4):282-286.

[6]Lin M, Wang Q, Zheng L, Huang Y, Lin F, Lin CP, Yang LY. Prevalence and molecular characterization of abnormal hemoglobin in eastern Guangdong of southern China. Clin Genet，2012，81(2):165-171.

[7]徐湘民.地中海貧血預(yù)防控制操作指南.北京：人民軍醫(yī)出版社，2011:11-13.

[8]Wan JH, Tian PL, Luo WH, Wu BY, Xiong F, Zhou WJ, Wei XC, Xu XM. Rapid determination of human globin chains using reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，901：53-58.

[9]Levi JE, da Costa Lira SM, de Carvalho Polite MB, d'Almeida Pereira RA, Mota M1, Bianco C, Kutner JM. Simultaneous blood donor screening for abnormal hemoglobin levels and glycated hemoglobin (HbA1c) by high-performance liquid chromatography. Transfusion，2015，55(9):2291-2292.

[10]陳素琴,蔣瑋瑩,陳路明,田秋紅,曾瑞萍.中國南方地區(qū)血紅蛋白 H 病的基因型與表型的相關(guān)性研究.新醫(yī)學(xué)，2015, 46(5)：294-298.

[11]Chao YH, Wu KH, Wu HP, Liu SC, Peng CT, Lee MS. Clinical features and molecular analysis of HbH disease in Taiwan. Biomed Res Int，2014，2014:271070.

[12]Schrier SL, Bunyaratvej A, Khuhapinant A, Fucharoen S, Aljurf M, Snyder LM, Keifer CR, Ma L, Mohandas N. The unusual pathobiology of hemoglobin constant spring red blood cells. Blood，1997，89(5):1762-1769.

(本文編輯：楊江瑜)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.07.015

通訊作者，秦丹卿，E-mail：qindanqing1985@163.com

(收稿日期：2015-11-06)

Genetic analysis and prenatal diagnosis of a family with novel α-globin gene mutation complicated with α-thalassemia

WangJicheng,DuLi,QinDanqing.

MedicalGeneticsCenterofGuangdongWomenandChildrenHospital,MaternalandChildrenMetabolic-GeneticKeyLaboratoryofGuangdong,Guangzhou511442,ChinaCorrespondingauthor，QinDanqing，E-mail：qindanqing1985@163.com

【Abstract】ObjectiveTo perform genetic analysis and prenatal diagnosis of a family with novel α-globin gene mutation complicated with α-thalassemia. MethodsPeripheral blood sample was collected from the family members for hemoglobin electrophoresis and red blood cell (RBC) analysis. Gap-PCR, PCR-RDB and DNA sequencing were utilized to detectα-globin gene mutation in the peripheral blood and villi samples. ResultsThe genotype of α-globin gene of the father was --/αα complicated with HbA2:c.52G>T (p.Val17Phe), and --/αCSα for the mother. The villi specimen detected that the genotype of fetus was αCSα/αα complicated with HbA2:c.52G>T mutation. ConclusionHbA2:c.52G>T mutation has not been reported. Abnormal hemoglobin induced by HbA2:c.52G>T mutation can aggravate the clinical symptoms of thalassemia.

【Key words】α-thalassemia；Point mutation; α-globin gene