秦　柏，石海紅，朱蓉嶸，張俊芳，楊　梅，管懷進

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CRLR基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性前房角關閉人群的關聯(lián)研究

秦柏，石海紅，朱蓉嶸，張俊芳，楊梅，管懷進

Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Correspondence to:Hai-Hong Shi. Department of Opthalmology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China. shihaihong2@163.com

Received：2016-04-25Accepted：2016-07-04

?AIM: To study the association of the single nucleotide polymorphism (SNP) rs1157699 in the calcitonin receptor-like receptor (CRLR) gene with primary angle closure (PAC) in a Han Chinese population.

?METHODS: All samples, involved 232 PAC cases and 306 controls, were obtained from an epidemiologic survey conducted in Funing, Jiangsu Province, China. Genotyping were carried out by TaqMan-MGB probe using the real time quantitative polymerase chain reaction system to study the relationship between SNP of rs1157699 in CRLR gene and PAC.

?RESULTS: The prevalence of CRLRrs1157699 genotype was 67.4%, 30.0%, 2.6% for CC, CT, TT in cases, and 71.3%, 27.0%, 1.7% in controls respectively. There was no difference between the two groups in the distribution of genotype and allele frequencies of rs1157699 (P>0.05).

?CONCLUSION: Our results do not support a significant role for rs1157699 in CRLR with PAC.

Citation:Qin B, Shi HH, Zhu RR,etal. Association of the single nucleotide polymorphisms in the calcitonin receptor-like receptor gene with primary angle closure in a Han Chinese population.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(8):1570-1572

摘要

目的：探討降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorpnism，SNP)與漢族原發(fā)性前房角關閉人群的關聯(lián)性。

方法：以流行病學人群為研究對象，采用病例對照設計。收集江蘇省阜寧縣流行病學調(diào)查中篩查出的原發(fā)性前房角關閉(primary angle closure，PAC)患者232例，正常對照306例。血樣經(jīng)DNA提取后采用TaqMan-MGB熒光探針法檢測CRLR基因的rs1157699(C/T)位點SNP基因型，比較兩組等位基因及基因型頻率的分布。

結(jié)果：病例組的基因型分布(CC 67.4%，CT 30.0%，TT 2.6%)，對照組的基因型分布(CC 71.3%，CT 27.0%，TT 1.7%)，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

結(jié)論：中國漢族人群的CRLR rs1157699位點SNP與原發(fā)性前房角關閉無相關性。

關鍵詞：原發(fā)性前房角關閉；降鈣素受體樣受體基因；單核苷酸多態(tài)性；中國漢族人群

引用：秦柏，石海紅，朱蓉嶸，等.CRLR基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性前房角關閉人群的關聯(lián)研究.國際眼科雜志2016;16(8):1570-1572

0引言

青光眼是全球第二大致盲眼病，不可逆盲是最主要的原因[1]。原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)是我國青光眼的主要類型，至2020年我國PACG的患者數(shù)將達到1 009萬，約占世界PACG總數(shù)的48%[1-2]。根據(jù)其自然病程可將PACG分為可疑原發(fā)性房角關閉(primary angle closure suspect，PACS)、原發(fā)性前房角關閉(primary angle closure，PAC)及PACG三個階段[3]。

房角關閉最大的危險因素是淺前房和窄房角，但是只有10%窄房角的人會發(fā)生房角關閉[4]。如能找出引起窄房角發(fā)生房角關閉的關鍵因素，就有可能阻止房角關閉和青光眼的發(fā)生。有研究[5]發(fā)現(xiàn)在瞳孔括約肌過度表達降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)的轉(zhuǎn)基因鼠易發(fā)生瞳孔散大和急性眼壓升高。劉杏等做了CRLR基因的rs1157699單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與PACG的關聯(lián)研究[6]，發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與原發(fā)性急性閉角型青光眼(acute primary angle-closure glaucoma，APACG)可能有關，而與原發(fā)性慢性閉角型青光眼(chronic primary angle-closure glaucoma，CPACG)無關。本研究以“江蘇眼病研究”中篩查出的PAC人群為對象，進一步探討該位點SNP與漢族PAC人群的關聯(lián)性。

1對象和方法

1.1對象本研究是江蘇眼病研究的一部分。研究方案經(jīng)南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有參加者簽署知情同意書。2011-05我們在鹽城市阜寧縣完成了PAC篩查，按偏倚控制要求統(tǒng)一管理現(xiàn)場調(diào)查，受檢率達90%，其中血樣標本收集率達95%，在接受調(diào)查的6 032人中篩選出年齡為50歲及以上的PAC 232例，對照組306例。病例組和對照組的一般情況見表1。兩組間在性別、年齡、全身病等方面無統(tǒng)計學差異，具有可比性。

1.2方法

1.2.1分組標準病例組(PAC組)：參照國際地域性和流行病學眼科學組的PACG的分級方法進行分組[7]。(1)任一眼房角鏡下或明、暗狀態(tài)下UBM檢查發(fā)現(xiàn)周邊虹膜與后部小梁接觸或粘連>180度；(2)至少有下列情況之一：眼壓>21mmHg；小梁網(wǎng)上有過多的色素沉積；虹膜萎縮；青光眼斑；有急性發(fā)作過的癥狀；暗狀態(tài)下UBM檢查眼壓較明狀態(tài)下升高≥8mmHg。(3)無青光眼視盤損害(視盤杯盤比≤0.5)及視野缺損；(4)排除外傷、手術、葡萄膜炎等引起的繼發(fā)性青光眼；既往無手術史及虹膜激光治療史；排除視網(wǎng)膜脫離、黃斑變性及嚴重白內(nèi)障影響眼底觀察者；(5)四代內(nèi)均為漢族。對照組：前房周邊深度大于2/3CT(coneal thickness)；眼壓小于21mmHg；無PACG家族史；視盤及視野正常；無明顯眼部病變,除了輕微白內(nèi)障不影響眼底觀察者；屈光不正小于3個屈光度；四代內(nèi)均為漢族。按性別、年齡與病例組頻數(shù)匹配。

1.2.2研究方法

1.2.2.1病史和相關混雜因素收集除性別、年齡、職業(yè)、文化程度、居住地等一般資料外，收集研究對象與PACG相關的其他因素，如慢性支氣管炎、糖尿病、高血壓等全身病患情況；皮質(zhì)類固醇等藥物使用情況；青光眼手術史及家族史等。測量血壓，檢測血糖、肝腎功能、血脂、血粘度等。

1.2.2.2眼部基本檢查參照我國九省眼病調(diào)查方案進行[8]，包括視力檢查(遠、近視力及日常生活視力)、裂隙燈檢查、眼底檢查、眼前節(jié)照相、眼底照相、Goldmann眼壓檢查、主覺驗光和客觀驗光等。

1.2.2.3 PAC篩查對淺前房眼進行前房角鏡、A超、UBM檢查，Humphrey視野檢查。(1)周邊前房深度的檢查：應用裂隙燈按Van Herick方法測量周邊前房深度[9]。將周邊前房深度≤1/3CT眼定為淺前房眼。(2)前房角鏡檢查：對淺前房眼行前房角鏡檢查，按Scheie分類法進行分級[10]。靜態(tài)下不能滿意看到房角隱窩時則在動態(tài)下檢查。觀察前房角寬度、入射角和虹膜根部形態(tài)。虹膜根部與后部小梁接觸>180°為接觸性關閉，虹膜根部與后部小梁粘連>180°為房角粘連性關閉，均納入PAC組，否則為房角開放。(3)明、暗條件下的UBM檢查：參照趙家良等的方法[11]，雙眼分別進行UBM(SW-3200A型便攜式UBM)檢查。分別對受檢眼上方、顳上方、顳側(cè)、顳下方、下方、鼻下方、鼻側(cè)及鼻上方8個位置進行檢查，先在暗室下檢查，結(jié)束后5min在距離受檢眼30cm處的30W白熾燈照射下重復以上檢查。記錄前房角接觸性關閉或粘連性關閉的范圍。(4)視野檢查：采用全自動視野計(Humphrey-720)進行中心及周邊視野檢查。(5)A超檢查：眼科A/B超儀(B-SCAN)測量前房深度、晶狀體厚度和眼軸長度。

表1研究對象的一般情況

一般情況對照組PAC組χ2/tP女性(例,%)268(87.58)209(90.09)0.82>0.05男性(例,%)38(12.42)23(9.91)平均年齡(x±s,歲)65.08±7.5364.84±8.590.34>0.05年齡范圍(歲)50～8550～83高血壓(例,%)66(19.64)46(19.83)0.16>0.05糖尿病(例,%)24(7.36)20(8.6)0.09>0.05腦血管疾病(例,%)10(3.27)4(1.72)1.18>0.05

1.2.3提取DNA收集血液樣本：在知情同意的前提下，采集每個研究對象的外周靜脈血，-4℃短暫保存。采用QIAGEN公司產(chǎn)品試劑抽提。(1)在200μL靜脈血中加入20μL蛋白酶、200μL Buffer AL 吹打混勻；(2)56℃水浴孵化10min，短暫全速離心，加入200μL無水乙醇，充分混勻；(3)將混合液移至Spin Column，全速離心1min，將離心柱移至2mL收集管；(4)加入500μL Buffer AW1，8 000r/min離心1min，將柱移至新收集管；(5)加入500μL Buffer AW2，全速離心3min；(6)將柱放入1.5mL離心管中，加入200μL Buffer AE，室溫下孵育5min，8 000r/min離心1min后-80℃保存。

1.2.4檢測SNP采用TaqMan-MGB法。使用雙探針分別探測PCR產(chǎn)物中所含的野生位點和SNP位點。檢測條件簡述如下：以10μL為反應體積，取1μL(10ng)DNA為模板，5μL 2×PCR反應液，0.2μL TaqMan-MGB探針及引物，余下用DEPC處理水補足。結(jié)果以雙探針(VIC或FAM)的熒光信號判定。

統(tǒng)計學分析：采用SAS 9.3軟件進行統(tǒng)計分析。病例與對照在性別、年齡、全身病等方面是否有差異采用t檢驗和卡方檢驗。對組內(nèi)SNP分布行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)檢驗；在加性模型(additive model，AM)，顯性模型(dominant model，DM)和隱性模型(recessive model，RM)下用Logistic回歸分析SNP與PAC的關系，計算優(yōu)勢比(odds ratio，OR)，95%可信區(qū)間(95%condidence interval，95%CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 HWE平衡檢驗基因分型檢出率為98.5%，其中對照組98.0%(300/306)，病例組99.1%(230/232)。對照組的HWE平衡檢驗，χ2=0.73，P>0.05；病例組的HWE檢驗，χ2=0.26，P>0.05，兩組均符合HWE平衡。

2.2兩組的基因型分布及等位基因頻率PAC組與對照組的基因型分布及等位基因頻率見表2，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。

3討論

PACG是一種由于前房結(jié)構(gòu)擁擠，導致前房角關閉、房水流出受阻，進而引起眼壓升高、視神經(jīng)損害的疾病。PACG的病因和發(fā)病機制尚不甚明確，目前多認為是一種多因素、多基因疾病[12]。淺前房是PACG最大的危險因素[13]，但目前無法預測淺前房是否會發(fā)生前房角關閉，以及何時會發(fā)生前房角關閉。

表2兩組的基因型和等位基因頻率比較

rs6759535基因型分布(例,%)對照組PAC組χ2POR(95%CI)等位基因C509(84.8)379(82.4)1.1420.2851.20(0.84～1.66)T91(15.2)81(17.6)基因型CC214(71.3)155(67.4)1.2610.53DM=1.20(0.83～1.75)CT81(27.0)69(30.0)0.9570.33RM=1.58(0.48～5.25)TT5(1.7)6(2.6)0.5690.45

rs1157699位于CRLR基因的第一內(nèi)含子區(qū)域，可能對基因的表達起調(diào)控作用。該序列變異可能導致CRLR過表達，進而導致腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin, AM)介導的瞳孔括約肌松弛，瞳孔擴大，從而引起急性前房角關閉[5]。AM是存在于心、腦、腎、眼等多種組織的多肽，在血管內(nèi)皮、血管平滑肌細胞、房水中可檢測到其表達[14-15]。通過與受體活性修飾蛋白2(RAMP2)和CRLR結(jié)合而發(fā)生生物學效應[16]。AM具有舒張血管，降低炎性滲出，降低內(nèi)皮細胞通透性的作用，從而具有保護心腦腎免受感染性休克、缺血和高血壓的損傷，維護血流、增加組織抗氧化應激的能力[17]。劉杏等做了APACG(109例)，CPACG(98例)與CRLR的rs1157699的關聯(lián)研究[6]，發(fā)現(xiàn)rs1157699與APACG可能相關，而與CPACG無關。在APACG組的基因型分布為CC 52.3%，CT 44%，TT 3.7%，在對照組的基因型分布為CC 67.3%，CT 29.3%，TT 3.4%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.024)，提示T等位基因可能是APACG的危險因素。但在多重矯正后失去了統(tǒng)計學意義(P=0.2)，我們認為有必要進行更大樣本量和不同人群的驗證。

本研究利用來自江蘇省鹽城阜寧縣流行病學調(diào)查篩選出的PAC人群，對rs1157699與PAC的關系進行了關聯(lián)研究。以流行病學人群為對象可以克服以醫(yī)院患者為對象的諸多局限性，如選擇性偏倚、回憶偏倚和對照組選擇上的偏倚，因而具有良好的可信性和代表性?？紤]到AM能增加組織血供，可能對視神經(jīng)損傷有保護作用，本研究選取了PAC群體為研究對象，不包括已發(fā)生視神經(jīng)損傷的PACG，這樣可以更好地反映基因序列變異與房角關閉發(fā)生的關系，去除一些混雜因素的影響。我們的研究結(jié)果顯示,PAC組的T等位基因頻率高于對照組，與劉杏等的研究相似，但差異無統(tǒng)計學意義。我們未能驗證劉杏等的結(jié)果[6]，可能有以下原因：(1)PACG系多因素疾病，其發(fā)病機制和遺傳方式非常復雜，可能是多種基因序列變異的累積效應及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。對于與遺傳有關的多因素疾病，由于每一個致病基因單獨所起的作用較小，即使對與疾病高度相關的SNP，在不同的研究中也常常得不到驗證[18]。另外，劉杏的研究對象為APACG，而我們的研究對象為PAC。結(jié)果的差異可能和疾病表型不同有關。由于我們阜寧流行病學中的PACG達不到關聯(lián)分析所需要的樣本量，本研究未做該位點與PACG的關聯(lián)分析。CPACG的發(fā)生雖然較APACG復雜，但兩者都具有共同的眼前節(jié)解剖特征，都是各種因素導致虹膜根部與房角相貼或粘連。

總之，我們的研究結(jié)果說明rs1157699與PAC之間無相關性。但也不能排除CRLR在原發(fā)性閉角型青光眼發(fā)病中的作用。有必要增加樣本量，選取多基因多位點進行關聯(lián)研究，進一步闡明PAC及PACG的發(fā)病機制。

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基金項目：江蘇省衛(wèi)生廳科技項目(No.H201424)

作者單位：(226001)中國江蘇省南通市，南通大學附屬醫(yī)院眼科

作者簡介：秦柏，畢業(yè)于南通大學，學士，技師，研究方向：眼科分子生物學。

通訊作者：石海紅，畢業(yè)于南通醫(yī)學院，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：青光眼發(fā)病機制.shihaihong2@163.com

收稿日期：2016-04-25 修回日期： 2016-07-04

Foundation item:Science and Technology Project of Department of Public Health in Jiangsu (No.H201424)

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.8.46

?KEYWORDS:primary angle closure; calcitonin receptor-like receptor gene;single nucleotide polymorphism; Han Chinese population

Association of the single nucleotide polymorphisms in the calcitonin receptor-like receptor gene with primary angle closure in a Han Chinese population

Bai Qin, Hai-Hong Shi, Rong-Rong Zhu, Jun-Fang Zhang, Mei Yang, Huai-Jin Guan

Abstract