孫凌聰，張華勛，裴速建，夏　菁，吳冬妮，林　文

(湖北省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病防治研究所，武漢 430079)

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湖北省首例輸入性卵形瘧原蟲wallikeri亞種的病原學(xué)診斷分析

孫凌聰，張華勛△，裴速建，夏菁，吳冬妮，林文

(湖北省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病防治研究所，武漢 430079)

摘要:目的應(yīng)用巢式PCR技術(shù)對1例罕見卵形瘧原蟲wallikeri亞種進(jìn)行診斷和鑒定。 方法采集初診為輸入性間日瘧患者血樣，進(jìn)行瘧疾快速診斷試劑盒、顯微鏡鏡檢和巢式PCR檢測，并進(jìn)行測序分析。 結(jié)果該患者瘧疾快速診斷試劑盒檢測陰性；鏡檢查見寄生于紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲環(huán)狀體和滋養(yǎng)體；采用卵形瘧原蟲wallikeri亞種特異性引物(rOVA1v/rOVA2v)進(jìn)行巢式PCR，在760 bp處有特異性擴(kuò)增條帶，測序后經(jīng)Blast比對，與GenBank數(shù)據(jù)庫中卵形瘧原蟲wallikeri亞種部分序列的一致性為99%。 結(jié)論該患者經(jīng)巢式PCR和序列分析確診為湖北省首例卵形瘧原蟲wallikeri亞種感染。

關(guān)鍵詞:輸入性瘧疾；卵形瘧原蟲wallikeri亞種；巢式聚合酶鏈反應(yīng)

卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)于1922年首次由Stephens描述并因其在紅細(xì)胞內(nèi)的卵圓形態(tài)而被命名[1]。其主要分布于非洲，尤其是西非及東南亞國家。最近研究發(fā)現(xiàn)，卵形瘧除經(jīng)典亞種(Plasmodium ovale curtisi)外還存在另一變異亞種(Plasmodium ovale wallikeri)，兩者無法通過鏡檢從形態(tài)上區(qū)分[2]。湖北省歷史上未見卵形瘧本地病例報道，但隨著境外勞務(wù)輸出的日益頻繁，輸入性卵形瘧呈較大幅度增加，但未見wallikeri亞種報道[3]。本研究對湖北省1例初診為輸入性間日瘧病例，采用巢式PCR鑒定，并進(jìn)行測序分析，結(jié)果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料患者男，31歲，荊門人，2013年11月赴非洲加納從事野外金礦開采，務(wù)工期間曾多次感染瘧疾(感染蟲種不詳)，均采用注射1～2 d抗瘧藥治療，2014年8月回國約6個月后，出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、全身酸痛等癥狀，經(jīng)縣人民醫(yī)院采血制片鏡檢診斷為間日瘧，后經(jīng)市級疾控中心鏡檢復(fù)核為輸入性間日瘧。采集該患者EDTA-Na2抗凝全血送省級疾控中心復(fù)核。

1.2儀器與試劑全血DNA 抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)購自QIAGEN公司，DNA聚合酶(PrimeSTAR?HS DNA Polymerase)購自Takara公司，PCR預(yù)混反應(yīng)體系(DreamTaq PCR Master Mix)購自Fermentas公司，瘧疾快速診斷試劑盒(Malaria rapid diagnostic tests，RDTs)購自廣州萬孚生物技術(shù)有限公司。顯微照相系統(tǒng)購自Leica公司，PCR擴(kuò)增儀和電泳儀購自Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購自Ultra-Violet公司。

1.3方法

1.3.1RDTs檢測取5 μL患者抗凝血，參照RDTs說明書進(jìn)行檢測。

1.3.2血涂片顯微鏡鏡檢取患者抗凝血制作有厚、薄血膜的血涂片，干燥、固定后采用Giemsa染色，油鏡(×1 000)下鏡檢瘧原蟲。

1.3.3巢式PCR檢測小亞基核糖體RNA(SSU rRNA)(1)參照文獻(xiàn)[4-5]設(shè)計瘧原蟲屬特異性引物rPLU5/rPLU6和間日瘧、惡性瘧、三日瘧、卵形瘧curtisi亞種和卵形瘧wallikeri亞種5種瘧原蟲的種特異引物(分別為rVIV1/rVIV2、rFAL1/rFAL2、rMAL1/rMAL2、rOVA1/rOVA2和rOVA1v/rOVA2v)。由寶生物工程(大連)有限公司合成，見表1。(2)DNA提取參照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取全血DNA，-20 ℃保存。(3)SSU rRNA第一輪擴(kuò)增：20 μL反應(yīng)體系中包含3 μL模板DNA，0.2 μL Taq DNA聚合酶，1.1 μL 6 μmol/L屬特異性引物，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，4.0 μL 5×Buffer和9.0 μL水；反應(yīng)條件為94℃變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共擴(kuò)增35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。SSU rRNA第二輪擴(kuò)增：20 μL反應(yīng)體系中包含第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，4對種特異性引物上、下游引物各1.0、10 μL 2×DreamTaq PCR Master Mix和補(bǔ)水至20 μL；擴(kuò)增條件與第一輪擴(kuò)增相同。(4)瓊脂糖凝膠電泳：取2.0 μL 6×上樣緩沖液與10 μL第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻，取6 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(90 V電泳40 min)，凝膠成像系統(tǒng)觀察。(5)測序分析：將第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast同源性分析。

表1　　基于SSU rRNA基因的瘧原蟲巢式PCR擴(kuò)增體系

2結(jié)果

2.1RDTs檢測結(jié)果患者抗凝血樣經(jīng)RDTs檢測，結(jié)果為瘧原蟲陰性。

2.2血涂片顯微鏡鏡檢結(jié)果血涂片鏡檢厚血膜查見環(huán)狀體和大滋養(yǎng)體；薄血膜中，被寄生的紅細(xì)胞大小正?；蚵钥s小，環(huán)狀體和早期滋養(yǎng)體核較大，胞質(zhì)較厚，大滋養(yǎng)體呈圓形，細(xì)胞質(zhì)堅實(shí)，空泡不顯著(圖1)。

注：A為厚血膜中的環(huán)狀體和大滋養(yǎng)體；B～D均為薄血膜，其中B為環(huán)狀體，C為早期滋養(yǎng)體，D為大滋養(yǎng)體。

圖1血涂片中的瘧原蟲(Giemsa染色，×1 000)

注：M為DNA標(biāo)志物；NP-1993為采用NP-1993 PCR體系；Pow為采用卵形瘧wallikeri亞種引物；1為空白對照；2為陰性對照；3～6分別為間日瘧、惡性瘧、三日瘧和卵形瘧curtisi亞種陽性對照；7、8為患者標(biāo)本。

圖2全血DNA巢式PCR檢測結(jié)果

2.3巢式PCR檢測結(jié)果采用NP-1933體系，患者樣本擴(kuò)增陰性；而以rOVA1v/rOVA2v為引物PCR擴(kuò)增出大小約760 bp的特異性條帶(圖2)。

2.4擴(kuò)增片段的序列分析結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序，長度約為754 bp，采用NCBI中Blast程序?qū)U(kuò)增序列(通過Bankit提交NCBI，GenBank登錄號為KU315239)進(jìn)行同源性比對，與GenBank中Plasmodium ovale wallikeri克隆GC-1 18S rRNA基因全序列(GenBank登錄號KF696359.1)及卵形瘧SUU rRNA基因(GenBank登錄號AJ001527.1)一致性均為99%。

3討論

卵形瘧每年在非洲引起超過1 500萬病例，由于其形態(tài)與間日瘧相似和隔日發(fā)作特點(diǎn)，常被誤診為間日瘧或三日瘧而導(dǎo)致其感染率被低估[6]。而目前被基層廣泛使用的RDTs產(chǎn)品對卵形瘧、三日瘧的診斷敏感性顯著低于間日瘧和惡性瘧，卵形瘧假陰性時常發(fā)生[7]。湖北省近幾年才陸續(xù)有輸入性卵形瘧報道，基層醫(yī)療單位對卵形瘧認(rèn)識不足，從而導(dǎo)致本例患者誤診為間日瘧。同時，卵形瘧與間日瘧一樣，有肝細(xì)胞期休眠子的存在，可導(dǎo)致復(fù)發(fā)[8]。本研究中的患者回國6個多月才發(fā)病，如遇適當(dāng)?shù)膫鞑ッ浇?，引起輸入性瘧疾在本地傳播的風(fēng)險較大。此外，雖然卵形瘧在其流行地區(qū)很少引起人類嚴(yán)重疾病，但可在外來人群中引起嚴(yán)重的臨床疾病[9]。因此，加強(qiáng)基層醫(yī)療單位對卵形瘧的認(rèn)識和診斷能力，對防止漏診和重癥病例發(fā)生非常重要。

卵形瘧原蟲兩個亞種形態(tài)上無法區(qū)分，僅潛伏期長短和潛在臨床癥狀有所區(qū)別[10]，只有通過分子生物學(xué)方法才能區(qū)分。按照中國消除瘧疾行動計劃和瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)文件要求，各省應(yīng)對每個瘧疾病例按照國家瘧疾比實(shí)驗(yàn)室推薦的巢式PCR方法(NP-1993體系[4])進(jìn)行基因檢測以明確感染蟲種[11]。但研究發(fā)現(xiàn)，自wallikeri亞種被發(fā)現(xiàn)并正式命名后，傳統(tǒng)的NP-1993體系僅對curtisi亞種敏感[12]。隨后針對新亞種卵形瘧的診斷技術(shù)和方法也不斷更新，并取得了很多成果[3]。本研究中患者采用NP-1993體系進(jìn)行巢式PCR檢測陰性后，采用Calderaro等[5]報道的卵形瘧原蟲wallikeri亞種特異性引物(rOVA1v/rOVA2v)，擴(kuò)增出特異性條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物測序后在NCBI上進(jìn)行同源性比對，確診為卵形瘧wallikeri亞種。

隨著中國前往非洲、東南亞等地區(qū)務(wù)工人員不斷增多，我國輸入性瘧疾疫情逐年上升，一些國內(nèi)較為少見的瘧疾類型，如三日瘧、卵形瘧及諾氏瘧原蟲。也不斷增多[11]。湖北省2013年后已無本地瘧疾病例報告，但隨著輸入性瘧疾不斷增多，卵形瘧病例顯著增加[4]。因此，加強(qiáng)基層醫(yī)療單位對少見瘧疾種類的培訓(xùn)，并在傳統(tǒng)鏡檢、RDTs方法基礎(chǔ)上，結(jié)合PCR等分子生物學(xué)診斷技術(shù)，對降低少見輸入性瘧疾病例的漏診、誤診，減少重癥病例發(fā)生及防止輸入性瘧疾在本地傳播，鞏固消除瘧疾的成果有重要意義。

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作者簡介：孫凌聰，男，主管檢驗(yàn)技師，主要從事寄生蟲病檢測、防治與研究。 △通訊作者，E-mail：530777955@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.022

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1956-03

(收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-20)

Analysis on etiological diagnosis of first case of imported Plasmodium ovale wallikeri subspecies in Hubei Province

SUNLingcong,ZHANGHuaxun△,PEISujian,XIAJing,WUDongni,LINWen

(ResearchInstituteofParasiticDiseases,HubeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuhan,Hubei430079,China)

Abstract:ObjectiveTo use the nested PCR technology to diagnose and identify a case of imported Plasmodium ovale wallikeri subspecies.MethodsBlood sample was collected from 1 case of initially diagnosed imported tertian malaria and performed the examination of microscopy,rapid diagnostic tests (RDTs) and nested-PCR.Moreover the sequencing was conduced.ResultsRDTs showed the negative result;the ring form and trophozoite of Plasmodium could be observed in the blood smear by microscopy;the Plasmodium ovale wallikeri subspecies specific primer rOVA1v/rOVA2v was adopted for conducting nested PCR,the specicific amplification band appeared at 760 bp,after sequencing and Blast aligning,its coincidence with the partial sequence of Plasmodium ovale wallikeri subspecies in the Genbank database was 99%.ConclusionThis patient is the first case of Plasmodium ovale wallikeri subspecies infection in Hubei province by nested PCR and sequencing analysis.

Key words:imported malaria;plasomdium ovale wallikeri;nested polymerase chain reaction