張　霞，胡大春

(云南省昆明市第一人民醫(yī)院檢驗科　650011)

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U266多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中CD138陰性細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

張霞，胡大春

(云南省昆明市第一人民醫(yī)院檢驗科650011)

摘要:目的從U266多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中分離CD138陰性細(xì)胞,對其進(jìn)行培養(yǎng)，觀察分離到的CD138陰性細(xì)胞的生長特性。方法用免疫磁珠法分離U266多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中的CD138陰性細(xì)胞，用干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果從U266多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中分離CD138陰性細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)呈球體生長。結(jié)論CD138陰性細(xì)胞具有干細(xì)胞生長的相關(guān)特征。

關(guān)鍵詞:多發(fā)性骨髓瘤；CD138；腫瘤干細(xì)胞

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種主要發(fā)生于中老年人群的惡性漿細(xì)胞腫瘤，在歐美國家血液腫瘤中的占比達(dá)10%。近年來，隨著我國進(jìn)入老齡化社會，MM的發(fā)病率已呈明顯上升趨勢[1]。目前MM治療措施已有大的進(jìn)步?？赏瑫r針對MM細(xì)胞本身和其所處微環(huán)境進(jìn)行大劑量化療治療，這些大劑量化療聯(lián)合應(yīng)用自體造血干細(xì)胞移植和(或)異體造血干細(xì)胞移植，使得部分患者可獲得完全緩解(CR)，但這些患者多數(shù)會出現(xiàn)復(fù)發(fā)。其復(fù)發(fā)的主要原因之一是存在于微量殘留病灶(MRD)，即在患者的體內(nèi)可能存在極少量能夠誘導(dǎo)腫瘤復(fù)發(fā)的“種子細(xì)胞”或者說“腫瘤干細(xì)胞”[2]。2012年Kawano等[3]發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)、進(jìn)展中的MM患者與未治療的MM患者比較，CD138陰性B細(xì)胞比例有著顯著增加。通過實驗研究也發(fā)現(xiàn)CD138陰性B細(xì)胞增多和MM患者的不良預(yù)后、細(xì)胞表型的更幼稚，以及對雷利度胺和治療表現(xiàn)為低敏感，這些特征都證明CD138陰性B細(xì)胞可能是MM 腫瘤干細(xì)胞。

1材料與方法

1.1材料人MM細(xì)胞U266購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。

1.2儀器與試劑改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；RNAiso Plus購自TaKaRa公司；CDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廣州復(fù)能基因有限公司；LONZA X-VIVO無血清培養(yǎng)基購自LONZA公司；rhIL-3、SCF和LIF購自PeproTech公司；PE-CD138抗體購自貝克曼公司；MicroBead CD138抗體購自德國美天旎公司。

1.3方法U266MM細(xì)胞株中CD138陰性細(xì)胞的分選和培養(yǎng)。首先對U266細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使用MicroBead CD138抗體和U266細(xì)胞進(jìn)行孵育，然后用分離系統(tǒng)分離獲取CD138陰性細(xì)胞，最后用干細(xì)胞培養(yǎng)基和干細(xì)胞培養(yǎng)6孔板進(jìn)行培養(yǎng)。5 d進(jìn)行1次傳代，2次傳代后在進(jìn)行1次免疫磁珠分離，培養(yǎng)5 d后觀察細(xì)胞生長的特征、流式細(xì)胞CD138陰性細(xì)胞純度的鑒定及傳代培養(yǎng)。干細(xì)胞培養(yǎng)基配制：由無血清LONZA X-VIVO培養(yǎng)基按比例加入20 ng/mL人類重組白細(xì)胞介素3(rhIL-3)、50 ng/mL白血病抑制因子(LIF)、20 ng/mL干細(xì)胞因子(SCF)。

2結(jié)果

2.1U266 MM細(xì)胞株中CD138陰性細(xì)胞分選與純度分析第1次磁珠法分選收集到CD138陰性細(xì)胞懸液，用PE-CD138熒光抗體染色，進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)純度分析，其中CD138陰性細(xì)胞數(shù)僅占41.4%。由于第1次分選到的細(xì)胞中CD138陰性細(xì)胞占比較低，不能滿足分析需求，因此對第1次分選收集到細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后在進(jìn)行第2次磁珠分選和第2次流式細(xì)胞技術(shù)純度分析。第2次磁珠分選后得到的CD138陰性細(xì)胞純度為71.6%，見圖1。

圖1　　第2次磁珠分選CD138陰性細(xì)胞結(jié)果

2.2CD138陰性細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)液中的生長情況CD138陰性細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)液中呈漂浮立體球狀生長，球體巨大，細(xì)胞之間結(jié)合緊密，其生長情況見圖2(低倍鏡)。

圖2　　　　　CD138陰性細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)液中的生長情況(10×)

3討論

2004年Matsui 證實MM腫瘤樣本和細(xì)胞系中存在克隆性極強(qiáng)的CD19+CD138-腫瘤干細(xì)胞[4],而源自MM細(xì)胞系和臨床患者骨髓標(biāo)本中的CD138-CD34-細(xì)胞也被認(rèn)為是MM干細(xì)胞[5]。而腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞增殖、化療耐藥、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要因素，更是治療的一個關(guān)鍵靶點(diǎn)[6]。

目前腫瘤干細(xì)胞研究的首要問題就是分離與鑒定。目前，腫瘤干細(xì)胞常用的分離方法有無血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法[7]、側(cè)群細(xì)胞法[8]、流式細(xì)胞分選法[9]和免疫磁珠分選法[10]。無血清懸浮培養(yǎng)法是人為地制造一富集腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，與腫瘤干細(xì)胞實際生長的體內(nèi)微環(huán)境不盡相同，目前有爭議；側(cè)群細(xì)胞法熒光染料本身具有細(xì)胞毒性，被標(biāo)記分選出的細(xì)胞活性有可能受到影響，從而影響實驗效果和準(zhǔn)確性；流式細(xì)胞分選法應(yīng)用廣泛，但耗時較長，分選的細(xì)胞活性可能受損影響功能；免疫磁珠法免疫磁珠特異性高，適合分選單個陽性表達(dá)的細(xì)胞，且分選的細(xì)胞純度及細(xì)胞活力均較高，并且可以短時間內(nèi)反復(fù)大量獲取所需要的干細(xì)胞。本試驗經(jīng)過2次磁珠分選后CD138陰性細(xì)胞地純度才達(dá)到71.6%。因為分選的CD138陰性細(xì)胞屬非陽性細(xì)胞，在分選過程中，附著在LD柱上的CD138陽性細(xì)胞可因多種因素進(jìn)入到CD138陰性細(xì)胞中，導(dǎo)致CD138陰性細(xì)胞的純度下降：(1)細(xì)胞因素，離心的細(xì)胞未用胰酶消化，細(xì)胞成團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)中心的細(xì)胞與免疫磁珠上的CD138抗體未充分接觸；細(xì)胞計數(shù)誤差大遠(yuǎn)低于實際細(xì)胞數(shù)，導(dǎo)致免疫磁珠CD138抗體用量不足；(2)免疫磁珠CD138因素，主要見于免疫磁珠的抗體效價下降，導(dǎo)致免疫磁珠CD138用量不足；(3)操作者因素，一次性在柱上加入大于說明書規(guī)定的buffer用量，將CD138陽性細(xì)胞帶入CD138陰性細(xì)胞中；(4)細(xì)胞自身因素，細(xì)胞活性下降，CD138陰性細(xì)胞含量很少等原因。因此欲獲取純度較高的CD138陰性細(xì)胞，一般都要經(jīng)過2次或多次分選才可能獲得較高純度。

在對CD138陰性細(xì)胞培養(yǎng)中，選擇2種刺激造血干細(xì)胞的細(xì)胞因子，rhIL-3和SCF刺激其生長。同時添加LIF抑制CD138陰性細(xì)胞向下分化，維持其多能性。另外選擇含有IMDM、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和人血清清蛋白無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加生長因子聯(lián)合配成干細(xì)胞培養(yǎng)基。

用干細(xì)胞培養(yǎng)液對CD138陰性細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d培養(yǎng)形成漂浮狀的球體細(xì)胞，通常干細(xì)胞生長的球體形狀可作為干細(xì)胞鑒定的一個依據(jù)，但是該方法仍有其自身的不足[11]：腫瘤球仍然是個混合細(xì)胞群體，它僅代表一小部分的腫瘤起源細(xì)胞，其潛在的異質(zhì)性通過腫瘤球篩選可能被丟失。另外，這些腫瘤球傳代要進(jìn)行大量擴(kuò)增，而在擴(kuò)增的過程中可能誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)和基因表達(dá)的改變，需要強(qiáng)有力的證據(jù)來鑒定細(xì)胞表面抗原。因此可選擇少量干細(xì)胞胚胎標(biāo)記物來對腫瘤球進(jìn)行鑒定，同時也可用TSC基于SP細(xì)胞特性、腫瘤細(xì)胞體外形成克隆能力、動物致瘤性試驗等來對腫瘤球進(jìn)行鑒定。目前已有資料表明MM中CD138陰性細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志SOX2[12]。本試驗由于經(jīng)費(fèi)非常緊張，未進(jìn)行相關(guān)的試驗進(jìn)行CD138陰性球體細(xì)胞的驗證，為本試驗的一個缺陷。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.041

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1999-03

(收稿日期：2016-01-28修回日期：2016-03-29)