姚廣龍，李　樂，邢炎慧，馬鳳菲，張莉娜，王新廣，羅先群

(海南大學(xué) 海南優(yōu)勢(shì)資源化工材料應(yīng)用技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228)

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海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性的初步研究

姚廣龍，李樂，邢炎慧，馬鳳菲，張莉娜，王新廣，羅先群

(海南大學(xué) 海南優(yōu)勢(shì)資源化工材料應(yīng)用技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228)

摘要：研究了海南全緣褶萼苔的表面消毒條件及其內(nèi)生真菌TX003菌株發(fā)酵液的抑菌活性。結(jié)果表明，采用75%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗4次，再用5.0%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗4次，是海南全緣褶萼苔表面消毒的最佳條件。其內(nèi)生真菌TX003菌株發(fā)酵液具有廣譜抑菌活性，對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌抑菌圈直徑分別達(dá)到17 mm、16 mm、13 mm、8 mm、11 mm。海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003可以產(chǎn)生具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，為新型抗菌藥物的篩選提供了新的途徑。

關(guān)鍵詞：全緣褶萼苔；內(nèi)生真菌；分離；抑菌活性

苔蘚植物是植物界由水生向陸生過渡的高等植物類群，從形態(tài)學(xué)上可分為苔綱(Hepaticae)、蘚綱(Musci)和角苔綱(Anthoeerotae)3類。苔綱約有5 000種，蘚綱約有15 000種，角苔綱有近100種[1]。為適應(yīng)生存環(huán)境、保護(hù)自己，苔蘚植物常能合成某些具有細(xì)胞毒、抗菌等活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。所以，幾乎所有苔蘚都不被自然界各種動(dòng)物和昆蟲所攝食，也不被細(xì)菌、真菌或病毒所感染。在研究苔蘚植物化學(xué)成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，萜類、半萜類、聯(lián)芐、雙聯(lián)芐、黃酮類化合物等生物活性物質(zhì)使苔蘚植物具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等特性[2-5]。

苔蘚內(nèi)生真菌是一類能定殖在苔蘚體內(nèi)靠苔蘚來獲取營養(yǎng)和保護(hù)卻不對(duì)苔蘚產(chǎn)生病害的微生物。20世紀(jì)末，研究者發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)后，內(nèi)生真菌的研究迅速成為熱點(diǎn)[6-7]。作者首次從海南全緣褶萼苔[Plicanthus birmensis(Steph.)R.M.Schust]中分離出內(nèi)生真菌，經(jīng)多次分離、純化，篩選出內(nèi)生真菌TX003，對(duì)其發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行了初步研究，旨在為海南苔蘚植物內(nèi)生真菌資源的研究提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料與菌種

海南全緣褶萼苔，采自海南省樂東市尖峰嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)海南大學(xué)園林園藝學(xué)院老師鑒定，憑證標(biāo)本存放在海南大學(xué)生物工程系實(shí)驗(yàn)室。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，由海南大學(xué)材料與化工學(xué)院生物工程系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：取去皮馬鈴薯200 g切成塊，煮沸0.5 h后紗布過濾，加入葡萄糖20 g、瓊脂粉15～20 g，定容到1 000 mL，pH值自然，于121 ℃滅菌20 min。首次分離內(nèi)生真菌時(shí)在此培養(yǎng)基中加鏈霉素(50 U·mL-1)抑制細(xì)菌生長。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基)：取去皮馬鈴薯200 g切成塊，煮沸0.5 h后紗布過濾，加入葡萄糖20 g，定容到1 000 mL，pH值自然，于121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，定容至1 000 mL，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

1.3方法

1.3.1海南全緣褶萼苔的表面消毒

除去海南全緣褶萼苔中枯枝和泥沙，洗潔精清洗幾遍，純凈水沖洗1 h，將全緣褶萼苔表面水分用無菌紗布吸干，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行全緣褶萼苔莖表面消毒，用印跡法檢驗(yàn)表面消毒效果。

具體過程如下：用75%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗4次；再用5.0%次氯酸鈉溶液分別浸泡2～6 min，無菌水漂洗4次，PDA培養(yǎng)基上做印記，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察平板，若沒有微生物長出，說明表面消毒效果良好。

1.3.2內(nèi)生真菌的分離與純化

無菌條件下，將表面消毒完全的全緣褶萼苔莖用無菌紗布吸干水分，剪刀剪小后，置于無菌研缽中充分研磨，無菌水稀釋，稀釋液涂布于PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。長出真菌后，挑取其尖端部分移至新的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次純化后，即得到全緣褶萼苔內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物TX001、TX002、TX003、TX004、TX005，于4 ℃冰箱保藏，備用。

1.3.3內(nèi)生真菌的發(fā)酵

將分離得到的TX003內(nèi)生真菌接種于PDB培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝40 mL培養(yǎng)液，搖床振蕩培養(yǎng)(180 r·min-1，25 ℃)7 d。將培養(yǎng)物(發(fā)酵液和菌球) 從三角瓶中倒入培養(yǎng)皿，在55 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干并稱量。研缽中研磨成細(xì)粉，以1 ∶10(g∶mL)的比例30 ℃下用丙酮浸漬18 h，再用超聲波提取發(fā)酵培養(yǎng)物內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)：溫度55 ℃，時(shí)間30 min，功率300 W。獲得海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003發(fā)酵液和菌球的丙酮提取液。

1.4抑菌活性評(píng)價(jià)[8]

采用雙層圓形紙片擴(kuò)散抑菌法評(píng)價(jià)抑菌活性?；罨茉嚲?，用接種環(huán)刮取一環(huán)受試菌于5 mL無菌水中，振蕩搖勻，得菌懸液，用涂布棒將平板中的菌液涂抹均勻。取經(jīng)高壓濕熱滅菌過的直徑為6 mm的圓形濾紙片浸漬丙酮提取液。兩片濾紙重疊，分別緊貼在涂布了細(xì)菌、真菌菌懸液的培養(yǎng)皿上。細(xì)菌37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，真菌28 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。測(cè)量抑菌圈直徑，做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，3組平行樣，取平均值。

2結(jié)果與討論

2.1海南全緣褶萼苔表面消毒最佳條件

海南全緣褶萼苔表面消毒效果如表1所示。

由表1可知，海南全緣褶萼苔莖先用75%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗4次；再用5.0%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗4次，可達(dá)到表面完全滅菌，且對(duì)內(nèi)生菌破壞最小，為全緣褶萼苔的表面消毒最佳條件。

2.2海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003的抑菌活性

海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003的抑菌活性篩選結(jié)果見表2。

由表2可知，海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003菌株發(fā)酵液對(duì)5種受試菌(4種細(xì)菌、1種真菌)均有較好的抑菌活性。由此可見，海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003在一些疾病的治療中有明顯的開發(fā)利用價(jià)值和前景，為新型抗菌藥物的篩選提供了新途徑。

表1海南全緣褶萼苔表面消毒效果

Tab.1　The surface disinfection results ofPlicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust

注：“-”表示沒有菌生長；“+”表示有菌生長，但是生長速度慢；“++”表示菌生長得較好。

表2TX003的抑菌活性篩選結(jié)果

Tab.2　Screening results of antibacterial activity of TX003

2.3討論

(1)目前從海南全緣褶萼苔分離內(nèi)生真菌多采用其莖部組織，可能是因?yàn)榍o中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于內(nèi)生真菌的生長。

(2)金黃色葡萄球菌危害大，是一種常見的病原菌，可引起多種嚴(yán)重感染，如心包炎、肺炎，甚至引發(fā)敗血癥、膿毒癥等全身感染。白色念珠菌常侵犯皮膚、粘膜，也可引起內(nèi)臟或全身感染。海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003菌株發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌都有良好的抑菌作用，有望作為人類抗感染藥物資源菌而進(jìn)一步開發(fā)。

(3)海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003菌株發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌及真菌的抑菌機(jī)制、抑菌活性成分及其化學(xué)結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

3結(jié)論

研究了海南全緣褶萼苔的表面消毒條件及其內(nèi)生真菌TX003菌株發(fā)酵液的抑菌活性。結(jié)果表明，采用75%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗4次，再用5.0%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗4次，是海南全緣褶萼苔表面消毒的最佳條件。其內(nèi)生真菌TX003菌株發(fā)酵液具有廣譜抑菌活性，對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌抑菌圈直徑分別達(dá)到17 mm、16 mm、13 mm、8 mm、11 mm。海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌TX003可以產(chǎn)生具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，為新型抗菌藥物的篩選提供了新的途徑。

參考文獻(xiàn)：

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[8]楊璐，蔡寅，姚帥,等.海南兩種江蘺不同提取物的抑菌活性[J].化學(xué)與生物工程，2015，32(2):40-42.

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(3114064，20753073)

>收稿日期：2016-01-31

作者簡(jiǎn)介：姚廣龍(1985-)，男，山東東阿人，講師，研究方向：熱帶植物資源開發(fā)與利用；通訊作者：羅先群，副教授，E-mail：luoxq35@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.012

中圖分類號(hào)：R 931.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)07-0052-03

Preliminary Study on Separation and Antibacterial Activity of Endophytic Fungi from HainanPlicanthusbirmensis(Steph.) R.M.Schust

YAO Guang-long,LI Le,XING Yan-hui，MA Feng-fei，ZHANG Li-na,WANG Xin-guang,LUO Xian-qun

(KeyLaboratoryofMinistryofEducationforApplicationTechnologyofChemicalMaterialsinHainanSuperiorResources,HainanUniversity,Haikou570228,China)

Abstract：The surface disinfection conditions of Hainan Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust and antibacterial activity of its endophytic fungi TX003 fermentation broth were investigated.Results showed that,soaked with 75% ethanol for 2 min,washed with sterile water for 4 times,and then soaked with 5.0% NaClO for 5 min,washed with sterile water for 4 times were the optimum surface disinfection conditions of Hainan Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust.The fermentation broth of the endophytic fungi TX003 had broad-spectrum antibacterial activity,and the inhibition zone diameters of Bacillus subtilis,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Candida albicans was 17 mm,16 mm,13 mm,8 mm,11 mm,respectively.The secondary metabolites with antibacterial activity could be produced from Hainan Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust endophytic fungi TX003.It provides a new way for the screening of new antibacterial drugs.

Keywords：Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust；endophytic fungi；separation；antibacterial activity

姚廣龍，李樂，邢炎慧，等.海南全緣褶萼苔內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性的初步研究[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(7)：52-54.