黃雨薇 葉元土 蔡春芳 吳 萍 陳科全 吳 韜 徐登輝 彭 侃 林秀秀羅其剛

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院， 蘇州 215123）

MDA對(duì)草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障損傷和肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成影響

黃雨薇 葉元土 蔡春芳 吳 萍 陳科全 吳 韜 徐登輝 彭 侃 林秀秀羅其剛

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院， 蘇州 215123）

油脂為魚類的生長提供能量和必需脂肪酸， 因此在飼料中得到廣泛應(yīng)用。然而， 油脂由于含有大量不飽和脂肪酸， 特別是魚油， 在高溫、高濕條件下特別容易氧化酸敗， 產(chǎn)生多種初級(jí)和次級(jí)氧化產(chǎn)物， 這些氧化產(chǎn)物被魚類攝食后， 會(huì)破壞其正常的生理功能， 危及健康生長［1， 2］。目前， 被廣泛關(guān)注的次級(jí)氧化產(chǎn)物有四羥基壬烯醛（4-HNE）和丙二醛（MDA）等［3］。MDA作為多不飽和脂肪酸氧化的最主要產(chǎn)物， 具有半衰期長和反應(yīng)性高的特點(diǎn)， 能通過細(xì)胞脂質(zhì)過氧化， 破 壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能引發(fā)蛋白質(zhì)交聯(lián)， 破壞酶活性， 損傷DNA等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， 進(jìn)而造成組織損傷［4， 5］。

腸道作為魚體自身與外界環(huán)境接觸的最大界面， 不僅具有消化吸收的作用， 還具有阻止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)的屏障功能， 從而達(dá)到維護(hù)魚體健康的目的。而完整的腸黏膜細(xì)胞和腸黏膜細(xì)胞間的連接作為腸黏膜機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)， 共同構(gòu)成了腸道的結(jié)構(gòu)性屏障［6］。緊密連接是腸黏膜細(xì)胞間最為重要的連接方式，主要由跨膜蛋白Occludin［7］、Claudins［8， 9］和胞漿蛋白ZOs［10， 11］構(gòu)成， 在維持腸道黏膜通透性和腸道屏障功能完整性方面具有重要作用［12］。

膽固醇又稱膽甾醇， 是細(xì)胞膜的重要組成成分， 又是體內(nèi)合成許多類固醇激素和膽汁酸的前體， 對(duì)于維持細(xì)胞膜的完整性和體內(nèi)生命活動(dòng)的正常運(yùn)行具有重要意義。3-羥基-3-甲基輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase， HMGCR）和膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7alpha-hydroxylase， CYP7A1）分別是合成膽固醇和膽汁酸的關(guān)鍵限速酶， 在維持機(jī)體膽固醇、膽汁酸動(dòng)態(tài)平衡中起著主要作用。肝胰臟不僅是魚類重要的代謝和解毒器官， 也是合成機(jī)體膽固醇、膽汁酸的主要場(chǎng)所。

研究報(bào)道， 氧化油脂會(huì)對(duì)動(dòng)物腸道的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷［13，14］。當(dāng)草魚腸道損傷時(shí)， 其肝胰臟、腸道的HMGCR、CYP7A1基因表達(dá)水平顯著上調(diào)［15］。在草魚灌喂氧化魚油的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 氧化魚油會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜膽固醇、膽汁酸合成基因通路表達(dá)上調(diào)［16］。在“氧化魚油對(duì)草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障損傷和肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成影響”（已投稿）的試驗(yàn)中也出現(xiàn)了類似結(jié)果，表明氧化油脂會(huì)引起腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障損傷和對(duì)肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成造成影響。而MDA作為魚油氧化的最主要產(chǎn)物， 是導(dǎo)致上述結(jié)果發(fā)生的主要因素嗎？目前還未見相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)在添加不同濃度MDA的條件下， 采用熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）對(duì)草魚腸道的6個(gè)緊密連接蛋白和肝胰臟、腸道的膽固醇、膽汁酸合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)活性進(jìn)行檢測(cè)， 并結(jié)合緊密連接結(jié)構(gòu)透射電鏡、腸道通透性指標(biāo)、血清、肝胰臟和腸道膽固醇、膽汁酸含量的變化進(jìn)行綜合分析， 旨在探討MDA對(duì)草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障損傷和肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

草魚來源于浙江一星飼料有限公司養(yǎng)殖基地， 為池塘培育的1冬齡魚種， 挑選體格健康、無畸形、體質(zhì)量為（74.8±1.2） g的草魚300尾魚， 隨機(jī)分為5組， 每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾魚。

1.2 試驗(yàn)飼料

以酪蛋白和秘魯蒸氣魚粉為主要蛋白源， 豆油為主要脂肪源， 根據(jù)等氮等能的原則， 設(shè)置了一個(gè)對(duì)照組（6S）和3個(gè)MDA處理組的試驗(yàn)飼料， MDA-1、MDA-2、MDA-3是通過在6S組飼料中噴灑4 mL含不同濃度MDA的反應(yīng)液后制得的3組試驗(yàn)組飼料， 具體配方及營養(yǎng)水平見表 1。飼料原料粉碎過60目篩， 用絞肉機(jī)制成直徑1.5 mm的長條狀， 切成1.5 mm×2 mm的顆粒狀， 風(fēng)干， 飼料置于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)%）Tab. 1 Formulation and proximate composition of experiment diets （DM %）

1.3 MDA的制備與添加

MDA的制備方法：根據(jù)GB/T 5009.181-2003的方法， 精確量取1，1，3，3-四乙氧基丙烷 （Sigma-Aldrich 公司，濃度≥99%） 31.5 mL， 用95%乙醇溶解后定容至100 mL，攪拌15min， 此時(shí)每毫升溶液相當(dāng)于MDA100 mg， 置于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

MDA的添加：按照每日3%的投喂率配置相應(yīng)的MDA， 采用現(xiàn)用現(xiàn)配的方式， 快速、均勻地噴灑在飼料當(dāng)中。MDA的添加量是根據(jù)試驗(yàn)“氧化魚油對(duì)草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障損傷和肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成影響”（已投稿）中氧化魚油的實(shí)際MDA含量設(shè)置的。

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在浙江一星飼料有限公司養(yǎng)殖基地進(jìn)行，在面積為5 m×667 m （平均水深1.8 m）的池塘中設(shè)置網(wǎng)箱， 網(wǎng)箱規(guī)格為（1.0 m×1.5 m×2.0 m）。飼養(yǎng)試驗(yàn)前用6S組飼料馴化一周， 正式飼養(yǎng)時(shí)間為72d， 每天7：00和16：00定時(shí)投喂， 投飼率為4%。每10天依據(jù)投飼量估算魚體增重并調(diào)整投喂率， 記錄每天投飼量。每周測(cè)定水質(zhì)一次， 試驗(yàn)期間水溫25—33℃， 溶解氧濃度＞8.0 mg/L，pH7.8—8.4， 氨氮濃度＜0.2 mg/L， 亞硝酸鹽濃度＜0.01 mg/ L， 硫化物濃度＜0.05 mg/L。

1.5 主要試劑

總RNA提取試劑RNAiso Plus， PrimeScriptTMRT Mastetr Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒， SYBR Premix Ex TaqTMI都來自TaKaRa公司， 熒光定量PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.6 樣品制備與分析

草魚生長數(shù)據(jù)的采集與分析 分別撈取各網(wǎng)箱草魚濾水后稱重， 記錄尾數(shù)， 用于生長速度計(jì)算， 并統(tǒng)計(jì)各組草魚增重量和投喂飼料量， 計(jì)算飼料系數(shù)和特定生長率。計(jì)算公式如下。

飼料系數(shù)（FCR）=飼料攝入量/（網(wǎng)箱末總重-網(wǎng)箱初總重）

特定生長率（SGR， %）=100×（ln網(wǎng)箱末總重-ln網(wǎng)箱初總重）

血清樣品的制備與分析 養(yǎng)殖72d、停食24h后，每網(wǎng)箱隨機(jī)取出10尾魚， 采用尾靜脈采血法， 取其全血置于離心管中， 常溫放置0.5h后， 3000 r/min離心10min制備血清樣品， 經(jīng)液氮速凍后， -80℃保存?zhèn)溆谩Ｑ宥费趸福―AO）活性采用南京建成的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。血清D-乳酸、內(nèi)毒素含量采用南京建成的Elisa試劑盒進(jìn)行測(cè)定。血清總膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）含量都采用雅培C800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

腸道組織透射電鏡樣品制備與分析 每網(wǎng)箱取2尾魚、每組6尾， 于中腸前四分之一處取1—2 cm腸管1段， 縱向剖開用磷酸緩沖液沖洗后， 立即將其投入4%戊二醛中固定， 用于透射電鏡分析。透射電鏡采用鋨酸固定、丙酮脫水， 最后放入膠囊內(nèi)包埋切片染色， 用日立HT7700透射式電子顯微鏡觀察腸道組織結(jié)構(gòu)并拍照。

草魚肝胰臟和腸道組織勻漿樣品制備與分析 分別取部分新鮮肝胰臟和腸道， 稱重后加入10倍體積0.02 mol/ L磷酸緩沖液（pH7.4）， 勻漿器10000 r/min勻漿1min， 3000 r/ min冷凍離心10min， 取上清液分裝， 液氮速凍后-80℃冰箱保存。肝胰臟和腸道TC、TBA含量都采用雅培C800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

草魚肝胰臟和腸道組織基因樣品制備 每網(wǎng)箱隨機(jī)選取抽過血的3尾魚活體解剖， 迅速取出內(nèi)臟團(tuán)置于冰浴中， 在肝胰臟中間部分和中腸的1/2處各取1.0 cm× 1.0 cm的一塊組織于PBS中， 漂洗2—3次后， 一式兩份， 迅速裝于EP管中， 液氮速凍， 于-80℃保存。

總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA 利用總RNA提取試劑RNAiso Plus按照說明書提取肝胰臟、腸道樣品總RNA。取1 μg總RNA為模板， 按照PrimeScriptTMRT Mastetr Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

qRT-PCR檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞間緊密連接蛋白和肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成關(guān)鍵酶基因表達(dá) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室草魚腸道轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）結(jié)果， 運(yùn)用prime5.0軟件設(shè)計(jì)了6個(gè)緊密連接蛋白和2個(gè)膽固醇、膽汁酸合成關(guān)鍵酶基因和內(nèi)參基因 β-actin （GenBank 登錄號(hào)：DQ211096）的熒光定量正、反向引物（表 2）。

表 2 實(shí)時(shí)熒光定量引物Tab. 2 Primers used for quantitative real-time PCR

實(shí)時(shí)定量檢測(cè)采用CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）進(jìn)行， 反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII （TaKaRa）10 μL， 候選引物各1 μL， cDNA 2 μL， 滅菌水6 μL。PCR反應(yīng)采用兩步法， 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s、95℃ 變性5s、60℃ 退火30s，共40個(gè)循環(huán)。同一樣品重復(fù)3個(gè)反應(yīng)， 以 β-actin作為參照基因。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct， 計(jì)算出目標(biāo)基因和參照基因 β-actin Ct值的差異ΔCt； 最后計(jì)算出不同樣品相對(duì)于參照樣品基因表達(dá)倍數(shù)2-ΔΔCt， 制作出相對(duì)定量的圖表。

1.7 數(shù)據(jù)分析

通過SPSS 21.0進(jìn)行One-way ANOVA分析， 并進(jìn)行LSD與Duncan氏比較， 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean± SD）表示， 當(dāng) P＜0.05時(shí)， 差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 MDA對(duì)草魚生長性能的影響

表 3 MDA對(duì)草魚生長的影響及飼料MDA含量與生長指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab. 3 Effect of MDA on the growth of Ctenopharyngodon idellus and the correlation analysis of them

由表 3可知， 與對(duì)照組相比， 在飼料中添加MDA后，草魚的SGR都出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）， 而FCR都出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。

在相關(guān)性分析中， 飼料MDA含量與SGR顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)， 而與FCR顯示正相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)。

2.2 草魚血清內(nèi)毒素、D-乳酸含量和DAO活性顯著增加

表 4 MDA對(duì)草魚腸道通透性的影響Tab. 4 Effect of MDA on the permeability of grass carp intestine

由表 4可知， 與對(duì)照組相比， 在飼料中添加MDA后，血清DAO活性、內(nèi)毒素含量和D-乳酸含量都出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）， 其中DAO、內(nèi)毒素含量在MDA-3組達(dá)到最大值， 與MDA-1、MDA-2組差異顯著。

2.3 MDA使草魚腸黏膜細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷

經(jīng)過72d養(yǎng)殖試驗(yàn)后， 各個(gè)試驗(yàn)組草魚腸黏膜細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的透射電鏡圖見圖版I。圖版I-A-D分別為對(duì)照組、MDA-1、MDA-2和MDA-3組（圖中箭頭所示為草魚腸黏膜細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)）， 在透射電鏡下， 緊密連接結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為一條條黑色的致密電子帶， 起始于上皮頂端， 從絨毛根部向基底層延伸。由圖版I-A可見， 對(duì)照組緊密連接結(jié)構(gòu)沒有縫隙， 圖版I-B-D箭頭所示處可以發(fā)現(xiàn)緊密連接結(jié)構(gòu)出現(xiàn)縫隙， 并且逐步擴(kuò)大， MDA-3組緊密連接結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損， 縫隙達(dá)到最大。結(jié)果顯示腸黏膜細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重的損傷。

2.4 MDA誘導(dǎo)草魚腸黏膜細(xì)胞間緊密連接蛋白基因表達(dá)顯著下調(diào)及相關(guān)性分析

對(duì)組成腸道黏膜細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果見圖 1。由圖 1可知， 與對(duì)照組相比， 在飼料中添加MDA后， 閉合蛋白Claudin-3、Claudin-15a， 閉鎖蛋白Occludin和胞漿蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3基因表達(dá)都顯著下調(diào)（P＜0.05）。

由表 5可知， 飼料MDA含量與閉合蛋白Claudin-3、Claudin-15a， 胞漿蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3和閉鎖蛋白Occludin基因表達(dá)均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)。

2.5 MDA對(duì)血清、肝胰臟、腸道TC、TBA含量和血清HDL/LDL的影響

MDA對(duì)血清TC、TBA、HDL/LDL的影響 由表6可知， 與6S組相比， 在添加MDA后， 血清TC含量都出現(xiàn)不同程度的增加， 在MDA-2和MDA-3組顯著增加（P＜0.05）， 而TBA含量都出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。

與6S組相比， 在添加MDA后， 血清HDL/LDL比值都出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。

MDA對(duì)肝胰臟TC、TBA含量的影響 由表 6可知， 與6S組相比， 在添加MDA后， 肝胰臟TC含量都出現(xiàn)不同程度的增加， 在MDA-2和MDA-3組顯著增加（P＜0.05）。在MDA組中， 肝胰臟TC含量在4OF組達(dá)到最大值， 與MDA-1組差異顯著 （P＜0.05）。

與6S組相比， 在添加MDA后， 肝胰臟TBA含量都出現(xiàn)不同程度的下降， 但差異不顯著（P＞0.05）。

MDA對(duì)腸道TC、TBA含量的影響 由表 6可知，與6S組相比， 在添加MDA后， 腸道TC含量除在MDA-3組出現(xiàn)下降外， 在MDA-1和MDA-2組顯著增加（P＜0.05）。

與6S組相比， 在添加MDA后， 腸道TBA含量都出現(xiàn)不同程度的下降， 差異顯著（P＜0.05）。

2.6 MDA對(duì)肝胰臟、腸道HMGCR、CYP7A1基因表達(dá)活性的影響及相關(guān)性分析

由圖 2可知， 在肝胰臟中， 與6S組相比， 在添加MDA后， HMGCR基因表達(dá)活性顯著上調(diào)（P＜0.05）， 而CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（P＜0.05）并且HMGCR基因表達(dá)活性在MDA-2組達(dá)到最大值， 與MDA-1、MDA-3組差異顯著（P＜0.05）。在腸道中， 與6S組相比， 在添加MDA后， HMGCR、CYP7A1基因表達(dá)活性都顯著下調(diào)（P＜0.05）。

由表 7可知， 在肝胰臟中， 飼料MDA含量與HMGCR基因表達(dá)活性顯示正相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)， 而與CYP7A1基因表達(dá)活性顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)。在腸道中，飼料MDA含量與HMGCR、CYP7A1基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)。

圖 1 MDA對(duì)草魚腸黏膜細(xì)胞間緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響Fig. 1 Tight junction protein gene expression of intestine in grass carp under MDA

表 5 飼料MDA含量與草魚腸黏膜細(xì)胞間緊密連接蛋白基因表達(dá)的相關(guān)性分析Tab. 5 Correlation analysis between the content of MDA in diets and tight junction protein gene expression of intestine in grass carp

3 討論

3.1 MDA對(duì)草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障損傷

MDA使草魚腸黏膜細(xì)胞間緊密連接蛋白基因表達(dá)顯著下調(diào) 如圖 3所示， 閉鎖蛋白Occludin和閉合蛋白Claudins是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)的主要跨膜蛋白， 相鄰腸黏膜細(xì)胞間通過跨膜蛋白Occludin、Claudins的胞外環(huán)以“拉鏈”狀相連接， 形成“鎖扣”結(jié)構(gòu)， 從而封閉細(xì)胞旁間隙， 在維持緊密連接的屏障功能和通透性上起著關(guān)鍵作用［17， 18］。胞漿蛋白ZOs是一類外周膜蛋白， 有三種異構(gòu)體（ZO-1、ZO-2、ZO-3）， 它們一端可以與跨膜蛋白Occludin、Claudins的胞內(nèi)域相連， 另一端可以與肌動(dòng)蛋白相結(jié)合， 從而將跨膜蛋白與細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)連接起來，構(gòu)成穩(wěn)定的緊密連接結(jié)構(gòu)［19］。胞漿蛋白ZOs可以將不同的信號(hào)傳遞到跨膜蛋白Claudins、Occludin， 對(duì)緊密連接結(jié)構(gòu)的“開啟”與“閉合”進(jìn)行調(diào)控［20］。研究表明， MDA對(duì)離體草魚腸道黏膜細(xì)胞膜具有損傷作用， 作用途徑可能是促使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化， 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［21］。在氧化豆油水溶物對(duì)離體草魚腸道黏膜細(xì)胞損傷的研究中提到，氧化豆油水溶物中的MDA可能是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的重要物質(zhì)之一［22］。在本試驗(yàn)中， 如圖 1所示， 在飼料添加MDA后， 閉鎖蛋白Occludin、閉合蛋白Claudin-3、Claudin-15a基因表達(dá)都出現(xiàn)不同程度的下調(diào)， 且差異顯著（P＜0.05）， 胞漿蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）， 同時(shí)表 5結(jié)果顯示， 飼料MDA含量與閉鎖蛋白Occludin， 閉合蛋白Claudin-3、Claudin-15a， 胞漿蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3基因表達(dá)均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)。上述結(jié)果表明， 飼料MDA減少了閉鎖蛋白Occludin、閉合蛋白Claudin-3、Claudin-15a的生成能力，削弱了胞漿蛋白ZOs對(duì)緊密連接“鎖扣”結(jié)構(gòu)的“閉合”調(diào)控， 通過打開緊密連接“鎖扣”結(jié)構(gòu)的方式， 導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞和腸黏膜通透性的增加， 損傷腸黏膜屏障。

表 6 草魚血清、肝胰臟、腸道TC、TBA含量和血清HDL/LDL的變化Tab. 6 The effect of contents of TC， TBA in serum， liver and intestine and the value of HDL/LDL in serum

圖 2 MDA對(duì)草魚肝胰臟和腸道HMGCR、CYP7A1基因表達(dá)活性的影響Fig. 2 The relative gene expression of HMGCR， CYP7A1 of liver and intestine in grass carp under MDA

表 7 肝胰臟、腸道HMGCR、CYP7A1基因表達(dá)活性相關(guān)性分析Tab. 7 Correlation analysis of HMGCR and CYP7A1 in the liver and intestine

圖 3 腸上皮細(xì)胞間的緊密連接示意圖Fig. 3 The tight junctions of intestinal epithelial intercellular

MDA使草魚腸黏膜通透性顯著增加 腸黏膜通透性的升高主要通過腸黏膜細(xì)胞通路和腸黏膜細(xì)胞間通路通透性增加來實(shí)現(xiàn)［23］。其中， DAO活性、D-乳酸和內(nèi)毒素含量經(jīng)常作為判斷腸黏膜通透性和腸黏膜屏障功能的指標(biāo)。

DAO是具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶， 該酶在小腸黏膜上層絨毛含量高， 活性強(qiáng)， 在其他組織含量少， 活性低。當(dāng)腸黏膜細(xì)胞受損、腸黏膜通透性增加后， 胞內(nèi)釋放大量的DAO會(huì)通過腸黏膜屏障而進(jìn)入血液， 使血漿DAO活性升高［24］。D-乳酸主要是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物， 正常情況下很少被吸收。當(dāng)腸黏膜細(xì)胞受損時(shí)， 腸黏膜通透性增加， 腸道中細(xì)菌產(chǎn)生大量D-乳酸會(huì)通過受損黏膜細(xì)胞進(jìn)入血液， 使血漿D-乳酸水平升高［25］。所以血漿DAO活性和D-乳酸含量可作為反映腸道黏膜損害程度和通透性變化的重要指標(biāo)。當(dāng)腸道屏障被破壞時(shí)， 腸黏膜通透性增加， 大量的內(nèi)毒素可通過腸黏膜細(xì)胞間通路、腸黏膜細(xì)胞微絨毛的細(xì)胞膜通路， 進(jìn)入血液引發(fā)內(nèi)毒素血癥。因此， 內(nèi)毒素的通透性可反映腸黏膜屏障的功能［26］。有研究表明， 腹瀉、感染和手術(shù)等多種應(yīng)激狀態(tài)均可導(dǎo)致暫時(shí)或長時(shí)間的腸黏膜屏障損傷， 表現(xiàn)為腸黏膜通透性增加、細(xì)菌和毒素移位等［27］。表 4結(jié)果顯示， 在飼料中添加MDA后， 血清DAO活性、D-乳酸和內(nèi)毒素含量都出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）， 表明飼料MDA破壞了腸黏膜細(xì)胞和腸黏膜細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)， 即腸黏膜屏障遭到嚴(yán)重?fù)p傷， 腸黏膜通透性顯著增加。

MDA使緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞 作為腸黏膜細(xì)胞間通路的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)， 緊密連接結(jié)構(gòu)只允許離子和可溶性的小分子通過， 大分子物質(zhì)及微生物難以通過， 通過緊密連接結(jié)構(gòu)的“開啟”與“閉合”實(shí)現(xiàn)腸黏膜細(xì)胞間通路的“開啟”與“閉合” 。Schmitz等［28］研究發(fā)現(xiàn)， 緊密連接發(fā)生變化會(huì)使腸黏膜屏障受損。如圖版I所示， 對(duì)照組緊密連接結(jié)構(gòu)沒有出現(xiàn)縫隙， MDA-1、MDA-2組緊密連接結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)縫隙， 并且逐步擴(kuò)大， MDA-3組緊密連接結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損， 縫隙達(dá)到最大。這些結(jié)果表明， 在飼料中添加MDA后， 緊密連接的“鎖扣”結(jié)構(gòu)會(huì)被打開， 緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞， 導(dǎo)致腸黏膜通透性增加。這也為腸黏膜細(xì)胞間緊密連接蛋白基因表達(dá)顯著下調(diào)導(dǎo)致腸道緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞和腸黏膜通透性的增加提供了很好的證據(jù)。

3.2 MDA對(duì)草魚生長性能的影響

腸道作為魚體消化和吸收的主要場(chǎng)所， 承擔(dān)著從外界獲取物質(zhì)、能量的重任。當(dāng)魚類的腸道屏障結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)， 必然會(huì)引起其攝食飼料的利用率降低， 從而阻礙其正常的生長、發(fā)育［29， 30］。上述結(jié)果表明， 飼料MDA會(huì)減少閉鎖蛋白Occludin、閉合蛋白Claudin-3、Claudin-15a的生成能力， 削弱胞漿蛋白ZOs對(duì)緊密連接“鎖扣”結(jié)構(gòu)的“閉合”調(diào)控， 使緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞， 導(dǎo)致腸黏膜通透性增加和腸黏膜屏障損傷， 最終破壞腸道屏障功能的完整性， 其結(jié)果發(fā)展的趨勢(shì)應(yīng)該會(huì)降低草魚的生長速度。由表 3結(jié)果顯示， 在飼料中添加MDA后， 草魚SGR顯著下降（P＜0.05）， 而FCR顯著升高（P＜0.05）， 同時(shí)在相關(guān)性分析中， 飼料MDA含量與SGR顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)， 而與FCR顯示正相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)， 表明MDA降低了草魚的生長性能， 這也為上述分析提供了有力的證據(jù)。

3.3 MDA對(duì)草魚肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成影響

MDA對(duì)草魚肝胰臟膽固醇、膽汁酸合成影響肝胰臟不僅是魚類重要的代謝和解毒器官， 也是機(jī)體合成膽固醇、膽汁酸的主要場(chǎng)所。Manwaring等［31］在小鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)MDA會(huì)與肝臟中的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)， 形成一種高分子量、水溶性的熒光物質(zhì)。Klamerth等［32］用MDA飼喂的大鼠肝臟DNA模板活性也明顯下降。本試驗(yàn)中， 在飼料添加MDA后， 肝胰臟膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGCR顯著上調(diào)（P＜0.05）， 而膽汁酸合成關(guān)鍵酶CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（P＜0.05）， 同時(shí)由表 7結(jié)果可知， 飼料MDA含量與HMGCR基因表達(dá)活性顯示正相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)， 而與CYP7A1基因表達(dá)活性顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)， 表明MDA會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞以乙酰輔酶A為原料合成膽固醇的能力增強(qiáng)和以膽固醇為原料合成膽汁酸的能力減弱， 由表 6結(jié)果顯示， 血清 HDL/ LDL的比值在丙二醛組都出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）， 也暗示著外周組織膽固醇轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞的能力在增強(qiáng)， 此時(shí)肝胰臟膽固醇含量應(yīng)該會(huì)出現(xiàn)增加， 而膽汁酸含量會(huì)出現(xiàn)減少的趨勢(shì)。Horton等［33］研究表明， MDA可以與大鼠肝臟線粒體中的乙醛脫氫酶高效且不可逆的結(jié)合從而影響線粒體的功能， 進(jìn)而損傷肝臟。由表 6結(jié)果顯示， 在飼料中添加MDA后， 血清、肝胰臟膽固醇含量都出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）， 而膽汁酸含量都出現(xiàn)不同程度的減少， 這不僅為上述分析提供了很好的證據(jù)， 也暗示在MDA的損傷作用下， 肝胰臟可能需要更多的膽固醇以滿足其生理代謝的需要， 而膽汁酸的需求可能會(huì)出現(xiàn)供給不足的局面。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)， 肝胰臟HMGCR基因表達(dá)活性在MDA-2組達(dá)到最大值， 與MDA-1、MDA-3組差異顯著（P＜0.05）， 肝胰臟膽固醇含量在MDA-2組達(dá)到最大值， 與MDA-1組差異顯著 （P＜0.05）， 表明在攝食含有0.12 g/kg MDA的飼料后， MDA對(duì)肝胰臟膽固醇合成的影響最大。

MDA對(duì)草魚腸道膽固醇、膽汁酸合成影響 腸道作為機(jī)體與外界接觸的最大界面， 在選擇性吸收營養(yǎng)物質(zhì)和防御有毒有害物質(zhì)入侵等方面發(fā)揮著屏障功能。Saito等［34］的研究發(fā)現(xiàn)， 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物會(huì)改變腸道細(xì)胞膜表面的酶活性甚至使其活性喪失。在本試驗(yàn)中， 在飼料中添加MDA后， 草魚腸道膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGCR、膽汁酸合成關(guān)鍵酶CYP7A1基因表達(dá)活性都顯著下調(diào)（P＜0.05）， 同時(shí)表 7結(jié)果顯示， 飼料MDA含量與HMGCR、CYP7A1基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢(shì)， 表明MDA會(huì)導(dǎo)致腸道細(xì)胞的膽固醇和膽汁酸合成能力減弱。有研究表明， MDA對(duì)離體草魚腸道黏膜細(xì)胞膜具有損傷作用， 作用途徑可能是促使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化， 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［21］。在氧化豆油水溶物對(duì)離體草魚腸道黏膜細(xì)胞損傷的研究中提到， 氧化豆油水溶物中的MDA可能是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的重要物質(zhì)之一［22］。在本試驗(yàn)中， 由表6結(jié)果顯示， 腸道膽固醇含量顯著增加（P＜0.05）， 而腸道膽汁酸含量顯著減少（P＜0.05）， 暗示在MDA損傷作用下，腸道可能需要更多的膽固醇以滿足其生理代謝的需要，膽汁酸的需求可能會(huì)出現(xiàn)供給不足的局面。

綜上所述， MDA會(huì)引起草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障遭到破壞和肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成能力受到影響， 而MDA作為魚油氧化的最主要產(chǎn)物， 是否會(huì)通過損傷草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)屏障的方式， 引起肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成能力的變化呢， 這有待后面進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼料MDA會(huì)減少閉鎖蛋白Occludin、閉合蛋白Claudin-3、Claudin-15a的生成能力， 削弱胞漿蛋白ZOs對(duì)緊密連接“鎖扣”結(jié)構(gòu)的“閉合”調(diào)控， 使緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞， 導(dǎo)致腸黏膜通透性增加和腸黏膜屏障損傷， 最終破壞腸道屏障功能的完整性， 從而降低草魚的生長性能。

隨著飼料MDA含量的增加， 肝胰臟膽固醇合成能力在增強(qiáng)， 其中以含有0.12 g/kg MDA的飼料對(duì)肝胰臟膽固醇合成的影響最大， 而膽汁酸合成能力在減弱， 致使肝胰臟、血清膽固醇含量增加和膽汁酸含量減少， 預(yù)示著肝胰臟可能需要更多的膽固醇以滿足生理代謝的需要， 而膽汁酸可能出現(xiàn)供給不足的局面。

隨著飼料MDA含量的增加， 腸道膽固醇、膽汁酸合成能力都在減弱， 而此時(shí)腸道膽固醇含量增加和膽汁酸含量減少， 預(yù)示著腸道同樣需要更多的膽固醇以滿足生理代謝的需要， 而膽汁酸可能出現(xiàn)供給不足的局面。

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THE DAMAGE OF INTESTINAL MUCOSA BARRIER STRUCTURE AND THE EFFECT OF CHOLESTEROL AND BILE ACID SYNTHESIS PATHWAY IN THE LIVER AND INTESTINE UNDER MDA IN GRASS CARP （CTENOPHARYNGODON IDELLA）

HUANG Yu-Wei， YE Yuan-Tu， CAI Chun-Fang， WU Ping， CHEN Ke-Quan， WU Tao， XU Deng-Hui， PENG Kan，LIN Xiu-Xiu and LUO Qi-Gang
（Key Laboratory of Aquatic Nutrition of Jiangsu Province， Suzhou University， Suzhou 215123， China）

丙二醛； 肝胰臟； 腸道； 膽固醇； 膽汁酸； 緊密連接

MDA； Liver； Intestine； Cholesterol； Bile acid； Tight junction

圖版 I 草魚腸道緊密連接的透射電鏡圖（×12000）Plate I TEM micrographs of the junction structures in grass carp

Q959； S965.1

A

1000-3207（2016）04-0869-10

10.7541/2016.112

2015-02-16；

2015-08-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31172417）； 蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（SYN201316）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation Project of China （31172417）； Applied Basic Research Project of Suzhou （SYN201316）］

黃雨薇（1989—）， 女， 四川宜賓； 碩士研究生； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料。E-mail： 1041372540@qq.com

葉元土， 教授； Tel： 0512-65880179； E-mail： yeyt@suda.edu.cn