鐘 蕾向建國曾 丹李寧求

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410128； 2. 水產(chǎn)動物免疫重點實驗室， 廣州 510380）

餌料對鳡腸道微生物多樣性的影響

鐘 蕾1向建國1曾 丹1李寧求2

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410128； 2. 水產(chǎn)動物免疫重點實驗室， 廣州 510380）

通過PCR-DGGE指紋分析并結(jié)合克隆、測序?qū)︼曃谷斯づ浜巷暳虾捅r魚兩種不同餌料的鳡腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異進行了比較研究。攝食配合飼料和冰鮮魚的鳡腸道樣品中分別檢測到21條和17條清晰的DGGE指紋條帶； 進一步的克隆、測序及BLAST比對分析表明， 21條測序譜帶與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知微生物的同源性為98%—100%。配合飼料飼養(yǎng)鳡腸道微生物特有條帶代表種群主要為魏斯氏菌（Weissella koreensis）等， 冰鮮魚飼養(yǎng)鳡特有條帶代表種為威斯康星米勒菌（Moellerella wisconsensis）等。從PCR-DGGE指紋相似性來看， 不同餌料飼養(yǎng)鳡的腸道細(xì)菌組成差異較為明顯， 相似性僅為11.9%—42.6%。鳡腸道菌群的DGGE 指紋圖譜中條帶的H′指數(shù)（Shannon-Weiner 指數(shù)）最高為配合飼料飼養(yǎng)鳡第Ⅴ組樣本， 達(dá)到2.84， 最低的為冰鮮魚飼喂下的鳡第Ⅵ組樣本， 為2.46。研究結(jié)果表明， 投喂人工配合飼料和冰鮮魚會對鳡腸道菌落產(chǎn)生影響， 可為鳡飼料的開發(fā)提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。此外， 兩類鳡的腸道群落PCR-DGGE指紋圖譜有助于這兩種鳡產(chǎn)品的跟蹤和腸道益生菌研究。

鳡； 腸道微生物； 變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）； 16S rDNA

鳡（Elopichthys bambusa）是我國少有的大型名貴魚類之一， 自然條件下主要以麥穗魚、鯽、鲌類等幼魚為食， 人工放養(yǎng)主要投喂鰱、鳙等家魚或冰鮮魚， 近年來改用馴化飼料飼喂［1］。該魚具有生長快、個體大、肉味鮮美、病害少、市場價格高等特點， 目前是我國淡水魚類中優(yōu)良的養(yǎng)殖對象， 具有廣闊的發(fā)展前景［2］。動物腸道微生物在宿主生長、營養(yǎng)和健康等方面起到重要的作用， 腸道內(nèi)的微生物類型、數(shù)量及分布比例受到攝食方式和種類的的影響， 動物體內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)合理有助于加快生長， 改善肉質(zhì)和減少疾病發(fā)生。郁二蒙等［3］通過PCR-DGGE技術(shù)比較分析了投喂不同餌料對大口黑鱸腸道微生物種類的影響， 發(fā)現(xiàn)投喂不同餌料的大口黑鱸腸道微生物種類相似度較低， 認(rèn)為魚類腸道菌群與宿主食性息息相關(guān)。王琴等［4］通過PCR-DGGE技術(shù)比較分析了3種不同混養(yǎng)模式下魚類腸道菌群， 結(jié)果表明3種混養(yǎng)模式下同種魚的腸道菌群存在差異且生長率也出現(xiàn)顯著性的差異。Uchii等［5］研究發(fā)現(xiàn)魚類腸道菌群隨魚類的生長和食物的改變而發(fā)生改變。目前大量研究均認(rèn)為水產(chǎn)動物腸道細(xì)菌群落與其生長和免疫均有緊密關(guān)系［6］。我國鳡養(yǎng)殖已逐步過渡到集約化生產(chǎn)， 飼喂飼料改變鳡的食性和生活習(xí)性， 這是否會引起鳡腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化， 國內(nèi)外還未見研究報道。本研究擬通過采集不同配比的豆粕替代魚粉組馴化飼料和冰鮮魚飼喂的鳡腸道內(nèi)容物， 進行菌群優(yōu)勢菌種的PCR-DGGE （聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳）鑒定與分析， 研究鳡腸道菌群的組成和分布特點， 以期為馴化飼料飼養(yǎng)鳡的腸道疾病、生長攝食和消化特性等研究積累基礎(chǔ)資料， 也為進而篩選出腸道益生菌并開發(fā)出高效且針對性強的微生態(tài)制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與馴化

實驗用鳡均采自湖南省慈利縣某養(yǎng)殖場的同一批魚種。實驗前于馴化養(yǎng)殖池投喂基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)2周， 后養(yǎng)于室外水泥池（6.0 m×1.5 m×2 m）中， 上午8：00和下午16：00分別飽食投喂配合飼料， 日換水量每次為總體積的1/3。暫養(yǎng)期間， 溶解氧含量保持在5.0 mg/L以上， pH 7.00±0.2， 水溫（25±1）℃， 總氨氮值不超過0.2 mg/L。

1.2 實驗設(shè)計

參照商品飼料配方， 在人工配合飼料組（總能約18.0 kJ/g， 表 1）中分別添加0、10%、20%、30%和40%豆粕替代魚粉組的基礎(chǔ)飼料， 配制等氮等能的5種試驗用配合飼料， 原料經(jīng)粉碎后用40目篩過濾， 用逐級擴大法混合微量成分， 后用雙螺旋壓條機制粒， 粒徑1.5 mm左右， 自然風(fēng)干后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

隨機挑選健康、規(guī)格一致的實驗鳡于室內(nèi)水族箱暫養(yǎng)馴化， 2周后挑選規(guī)格均勻的鳡（25.27± 0.40） g隨機分配到21個水族箱， 每箱放養(yǎng)30尾， 每組3個重復(fù)， 日投餌量為體質(zhì)量的3%—5%， 養(yǎng)殖持續(xù)32周。在養(yǎng)殖實驗結(jié)束后， 按照無菌操作法采集各試驗組和對照組鳡的腸道壁和腸道內(nèi)容物樣品，放于滅菌后的1.5 mL EP管中， 置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 試驗用配合飼料的配方Tab. 1 Formulation of compound feed in the experimental diet

1.3 腸道菌群總DNA的提取及16S rDNA V3區(qū)擴增

腸道菌群總DNA的提取采用糞便基因組DNA提取試劑盒（北京TIANGEN）參照說明進行。然后利用引物357F （5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和517R （5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）進行PCR擴增， 其中正向引物5′端添加GC-clamp （5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGG-3′）。PCR體系為10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、MgCl24 μL、引物（10 μmol/L）各1 μL、Ex Taq （大連TaKaRa） 1.5 U、模板DNA 20—50 ng、滅菌超純水補齊至50 μL。

擴增程序： 94℃ 預(yù)變性5min、變性1min，48℃復(fù)性1min， 72℃延伸1min， 30個循環(huán)； 72℃延伸10min。后經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物鑒定。采用PCR純化試劑盒（大連TaKaRa）將100 μL PCR產(chǎn)物濃縮至30 μL， -20℃保存。

1.4 變性梯度凝膠電泳及克隆測序

采用Dcode通用突變檢測系統(tǒng)（Bio-Rad， 美國）進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）， 變性梯度40%—70%， 膠濃度為6%—12% （m/v）， 上樣量為15 μL，60℃下65 V電泳16h， SYBR Green染色。用Gel Doc XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad）拍照。

將DGGE圖譜上明顯的特異條帶和共有條帶使用TaKaRa MiniBEST DNA 純化試劑盒（大連TaKaRa）進行PCR產(chǎn)物純化。使用Tiangen pGMT連接克隆試劑盒與TOP10感受態(tài)細(xì)胞（北京TIANGEN）進行克隆。每個樣品挑選上一步驟克隆得到的白色菌落各3個， 搖菌， 提質(zhì)粒， 使用T7引物（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）測序（測序儀為美國ABi3730xL DNA Analyzer）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Quantity One 4.6.3分析軟件對PCR-DGGE圖譜進行條帶記數(shù)及分析， 多樣性指數(shù)用Shannon-Weiner指數(shù)（H′）表示［9］， H′指數(shù)按照如下公式進行計算：

H′=-ΣPilogPi

其中， Pi為泳道中i條帶出現(xiàn)的可能性； Pi=ni/H，ni為某一條帶的峰高， H為泳道密度曲線所有的峰高的總和。采用UPGMA （Unweighted pair-group method with arithmetic averages）法進行相似性聚類分析［10］。用DNAMAN6.0.3軟件編輯測定的序列，并輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對， 分析基因相似性并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 腸道微生物DGGE指紋圖譜分析

不同餌料（人工配合飼料、冰鮮魚）飼養(yǎng)鳡， 腸道內(nèi)容物菌群的16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜（圖 1左）顯示， 配合飼料飼養(yǎng)鳡DGGE圖譜上共檢測到21條可鑒別的條帶， 冰鮮魚飼養(yǎng)的鳡可鑒別的條帶為17條， 兩者之間的共性帶有11條。在特異條帶中， 譜帶7、8、10、12、17和20為配合飼料飼養(yǎng)鳡的優(yōu)勢特異條帶， 譜帶2、7、8和20為冰鮮魚飼養(yǎng)鳡的優(yōu)勢特異條帶。從泳道相似性來看（圖1右）， 以Ⅶ號樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣， Ⅰ—Ⅴ號為配合飼料飼喂下鳡腸道細(xì)菌條帶， 其相似性最高達(dá)77.8%，Ⅵ、Ⅶ號為冰鮮魚飼喂下鳡腸道細(xì)菌條帶， 其相似性最高為66.5%， 表明在同種養(yǎng)殖模式下， 鳡腸道細(xì)菌條帶的數(shù)量、位置和亮度差異不很顯著， 但在不同養(yǎng)殖模式下鳡的腸道細(xì)菌DGGE差異較為顯著，相似性為11.9%—42.6%。

圖 1 配合飼料和冰鮮魚飼養(yǎng)鳡的腸道微生物DGGE圖譜及泳道相似性Fig. 1 Compound feed and ice fresh fish breeding bambusa intestinal bacteria content of similarity in the DGGE profiles and lane

2.2 腸道內(nèi)容物細(xì)菌的DGGE顯著條帶的測序結(jié)果分析

從DGGE指紋圖譜中選取22條顯著條帶切膠回收， 第18條帶異常， 無法回收測序， 其余21條回收成功， 得到200 bp左右條帶， 挑取陽性克隆子進行測序。通過BLAST比對， 在21個測序結(jié)果中，與GenBank數(shù)據(jù)庫中微生物的同源性為98%—100%。其中配合飼料飼養(yǎng)鳡特異條帶代表種為Uncultured bacterium （KF031440.1）、Bacillus subtilis （KF835839.1）、Staphylococcus sp. （KF828860.1）、Uncultured Caldisericum sp.（JN806348.1）和Plesiomonas shigelloides （KF698726.1）等， 冰鮮魚飼養(yǎng)鳡特異條帶代表種為Moellerella wisconsensis （NR_104939. 1）、Bacillus subtilis （KF835839.1）和Uncultured bacterium （HM821403.1）等。

2.3 腸道內(nèi)容物細(xì)菌的多樣性和相似性分析

通過計算不同養(yǎng)殖模式下鳡腸道菌群的DGGE指紋圖譜中條帶的H′指數(shù)（表 2）， 發(fā)現(xiàn)配合飼料飼喂鳡腸道菌群的多樣性指數(shù)偏高， 最高為第Ⅴ組樣本， 達(dá)到2.84， 其次為第Ⅳ組樣本， 為2.77， 最低的為冰鮮魚飼喂下的鳡樣本第Ⅵ組， 為2.46。Simpson指數(shù)結(jié)果顯示各組差異不大， 最高為第Ⅴ組樣本0.093， 最低的為第Ⅵ組樣本0.065。Pielou均勻度指數(shù)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性， 配合飼料飼喂鳡腸道菌群均勻度指數(shù)為0.159—0.189， 從第Ⅰ組到第Ⅴ組依次升高， 冰鮮魚飼喂下的鳡兩組數(shù)據(jù)較為接近， 分別為0.159和0.160。通過相似性聚類分析， 結(jié)果顯示不同飼喂?fàn)顟B(tài)下鳡腸道菌群的相似性范圍值為30%—80%， 兩種飼喂模式下的菌群相似性差異較大， 同一飼喂?fàn)顟B(tài)下的樣本之間也存在差異（圖 2）。

圖 2 配合飼料和冰鮮魚飼喂鳡的腸道內(nèi)容物細(xì)菌DGGE聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of DGGE profiles for bacterial community in the intestinal contents from compound feed and ice fresh fish feeding Elopichthys bambusa

3 討論

3.1 攝食對鳡腸道菌群種類和數(shù)量的影響

魚類腸道菌群的種類和數(shù)量反映出與宿主間相互依賴、相互制約的微生態(tài)關(guān)系， 在魚類的生長發(fā)育、營養(yǎng)水平和免疫防疫等方面也發(fā)揮著重要的作用。魚類食性不同， 腸道菌群組成會有所差異。郁二蒙等［7］通過對攝食不同餌料草魚腸道菌群PCR-DGGE指紋圖譜構(gòu)建及分子鑒定， 發(fā)現(xiàn)脆化草魚和氹仔草魚腸道內(nèi)容物細(xì)菌群落差異顯著。McIntosh等［8］發(fā)現(xiàn)， 在大西洋鱈（Gadusmorhua L.）最初的生長期內(nèi)， 分別喂養(yǎng)輪蟲和小蝦的幼魚， 其腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化， 呈現(xiàn)截然不同的兩種菌落結(jié)構(gòu)。Bakke等［9］也對鱈的幼魚飼喂三種不同的活飼料， 研究組之間腸道菌群亦存在不同的差異。本研究發(fā)現(xiàn)， 攝食冰鮮魚的鳡腸道內(nèi)以Uncultured bacterium、Moellerella wisconsensis strain和Bacillus subtilis為主， 而攝食人工配合飼料飼養(yǎng)鳡腸道內(nèi)以Weissella koreensis、Uncultured bacterium、Bacillus subtilis、Moellerella wisconsensis、Staphylococcus sp.、Staphylococcus gallinarum等為優(yōu)勢菌群。這一結(jié)果表明， 魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)和相似性與食物有著密切的關(guān)系， 細(xì)菌可以通過攝食進入魚的消化道， 使消化道內(nèi)細(xì)菌的種類和數(shù)量增加。

表 2 配合飼料和冰鮮魚飼喂鳡的腸道菌群DGGE圖譜的多樣性指數(shù)Tab. 2 Shannon diversity index H' of bacterial DGGE profile of compound feed and ice fresh fish feeding Elopichthys bambusa

3.2 不同攝食狀態(tài)下鳡腸道菌群差異性

攝食配合飼料鳡和攝食冰鮮魚鳡間的腸道菌群相似性存在差異。Pielou均勻度指數(shù)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性， 配合飼料飼喂鳡腸道菌群均勻度指數(shù)從第一組到第Ⅴ組依次升高， 而冰鮮魚飼喂下的鳡兩組數(shù)據(jù)較為接近。相似性聚類分析顯示兩種飼喂模式下的菌群相似性差異較大， 同一飼喂?fàn)顟B(tài)下的樣本之間也存在差異。李可俊等［10］對8種野生魚的腸道菌群的結(jié)構(gòu)分析， 也表明了食性差異大的魚類之間腸道菌群差異也更為明顯。

腸道內(nèi)容物DGGE圖譜顯示， 配合飼料與冰鮮魚飼養(yǎng)鳡分別有21條和17條可鑒別的條帶， 通過BLAST比對， 配合飼料飼養(yǎng)鳡特異條帶代表種為魏斯氏菌該菌產(chǎn)酸速度快、耐算能力強， 其產(chǎn)酸、產(chǎn)細(xì)菌素能力對飼料添加劑行業(yè)發(fā)展具有重要意義［11—13］。另一種優(yōu)勢菌枯草桿菌， 目前國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于制作飼料添加劑和水質(zhì)改良劑， 該菌耐酸堿和抗菌性較強， 對水生動物益生作用明顯， 能有效改善水質(zhì)， 增強動物腸道消化酶活性， 以及提高機體免疫力［14—16］。冰鮮魚飼養(yǎng)鳡特異條帶代表種中也有枯草桿菌， 但未見魏斯氏菌。從實驗發(fā)現(xiàn)，益生菌群主要出現(xiàn)在人工配合飼料豆粕替代冰鮮魚試驗組的前三組中， 說明飼料中蛋白質(zhì)含量對胃腸道中益生菌的存在有一定的影響。研究者認(rèn)為益生菌在胃腸道微生物多樣性生態(tài)系統(tǒng)功能中起著重要的作用［17］。Yang等［18］采用DGGE技術(shù)研究了益生菌對石斑魚腸道菌群的影響， 發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌能選擇性地刺激利用益生菌， 而一些潛在的有害菌種被抑制生長。本研究從實驗鳡腸道中分離純化出兩種益生菌， 為鳡腸道益生菌制劑的研制提供了一些基礎(chǔ)依據(jù)。

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EFFECTS OF DIFFERENT DIETS ON INTESTINAL MICROBIOTA OF ELOPICHTHYS BAMBUSA

ZHONG Lei1， XIANG Jian-Guo1， ZENG Dan1and LI Ning-Qiu2
（1. College of Animal Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2. Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology， Guangzhou 510380， China）

In the present study， the sample of intestinal contents of Elopichthys bambusa which was feed by artificial diet and ice fish was collected to construct PCR-DGGE fingerprinting， the population structure and the diversity of intestinal bacteria in Elopichthys bambusa was investigated by cloning and sequencing the purposes binding strips. The DGGE fingerprints of intestinal contents showed that 21 and 17 bands were observed from Elopichthys bambusa which was feed by artificial diet and ice fish； through BLAST comparison， the sequencing results revealed that the similarity between sequencing gained and GenBank was 98%—100%. The representative species of Elopichthys bambusa which was feed by artificial diet were Weissella koreensi， etc. And the representative species of Elopichthys bambusa which was feed by ice fish were Moellerella wisconsensi， etc. From the similarity of lanes and bands， there were more significant difference between intestinal bacteria in different Elopichthys bambusa culture pattern， and the similarity was 11.9%—42.6%. The highest band H′ index in DGGE fingerprint of Elopichthys bambusa intestinal bacteria was the fifth set of samples which was feed by artificial diet， and to 2.84， the lowest was the sixth set of samples which was feed by ice fish， and under 2.46. The results of this study suggested that， feeding artificial feed and iced trash fish affected the composition of fish intestinal microflora， and this provided basic references to diets development. Furthermore， the PCR-DGGE fingerprinting of intestinal bacteria in two types of Elopichthys bambusa was benefit to product tracking and probiotics research.

Elopichthys bambusa； Gut microbes； PCR-DGGE； 16S rDNA

S829.1

A

1000-3207（2016）04-0830-06

10.7541/2016.107

2015-09-06；

2016-01-20

國家級星火計劃重大項目（S2012D200021）； 農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室開放課題（201307）資助 ［Supported by the China Spark Program （S2012D200021）； Open Project of Key Laboratory of Fishery Drug Discovery in Agriculture Ministry （201307）］

鐘蕾（1976—）， 女， 湖南桃江人； 博士； 主要從事水產(chǎn)動物疾病研究。E-mail： zhonglei-5@163.com

向建國（1968—）， 男， 湖南石門人； 碩士； 主要從事水產(chǎn)生態(tài)學(xué)研究。 E-mail： xjg68102000@aliyun.com