李榮富　高廣周　孫　濤　王志紅

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·基礎(chǔ)研究·

骨髓間充質(zhì)干細胞在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型結(jié)腸的定位

李榮富高廣周孫濤王志紅

230032合肥市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科(李榮富，王志紅)；100048北京，海軍總醫(yī)院消化內(nèi)科(高廣周，孫濤)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因和發(fā)病機制尚不清楚的慢性腸道炎性疾病，近年來UC的患病率呈明顯升高趨勢，有報道約為11.6/10萬[1]，目前缺乏有效的治療方法。1996年Tyndall等[2]用異體造血干細胞移植治療白血病合并UC患者時，發(fā)現(xiàn)其對白血病起治療作用的同時，也明顯改善了UC的癥狀，這為UC的治療方法研究提供了新的思路。目前干細胞移植用于UC的治療是國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點之一。本研究旨在探討骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)在小鼠遠端結(jié)腸的定位情況，為干細胞移植治療UC的實驗研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康BALB/c小鼠，雌性(8周齡)30只，雄性(3周齡)4只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)2007-004，飼養(yǎng)于海軍總醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物實驗室。

1.2主要試劑及儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基(Thermo)；PE標記小鼠抗人CD44、CD34、CD45、CD90抗體(Biolegend)；葡聚糖硫酸鈉(MP Biomedicals)；兔抗SRY蛋白單抗(Sigma)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)；倒置熒光顯微鏡(Nikon)。

1.3BMSC的分離培養(yǎng)及鑒定

脫臼處死雄性小鼠，無菌條件下分離脛骨及股骨，暴露骨髓腔，用培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集后過濾離心，1000 r/min離心5 min，棄上清液后用培養(yǎng)液重懸細胞，37 ℃，5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。72 h首次換液，細胞繁殖長滿瓶底90%時，按1∶2比例傳代。細胞培養(yǎng)過程中逐日觀察細胞貼壁特性及形態(tài)。并利用流式細胞儀檢測P3代細胞CD34、CD44、CD45、CD90的表達情況。

1.4實驗動物分組及UC模型的建立

30只雌性BALB/c小鼠隨機分為2組，移植組[5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)+干細胞移植]20只，空白組10只。根據(jù)Kihara等[3]方法建立急性DSS小鼠UC模型，將DSS溶于蒸餾水，配成5%DSS溶液，讓移植組小鼠自由飲用7 d，建立UC模型。

1.5小鼠疾病活動指數(shù)評分

造模期間每日觀察造模小鼠的體質(zhì)量變化、大便性狀及便血情況，按表1[4]進行評分，得出每只小鼠的疾病活動指數(shù)(DAI)評分(表1)。

表1　DAI評分標準

注：正常成形大便；松散不黏附于肛門的糊狀、半成形大便；稀便可黏附于肛門的稀水樣便

1.6 BMSC移植及取材

造模后，移植組小鼠經(jīng)鼠尾靜脈回輸P3代雄性小鼠BMSC，細胞數(shù)目和液體量為每只1×106/0.4 mL；空白組小鼠各經(jīng)鼠尾靜脈回輸生理鹽水0.4 mL。移植組及空白組于移植后0 d(BMSC移植前)、3 d、7 d、14 d、21 d分別處死4只及2只。小鼠麻醉后仰臥位固定，暴露腹腔組織，距肛門1 cm處取結(jié)腸組織2 cm，以10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，共切3張，用于組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色、性別決定區(qū)Y(SRY)蛋白免疫組織化學(xué)染色。

2結(jié)果

2.1BMSC培養(yǎng)結(jié)果

原代細胞培養(yǎng)12 h，可見細胞貼壁現(xiàn)象，72 h首次換液后，可見瓶底貼壁細胞散在生長，分布不均，部分呈集落狀或單個細胞存在，胞體呈長梭形，兩端有長突起，折光性差，核不清楚(見圖1A)。原代培養(yǎng) 7 d，懸浮細胞已清除，貼壁細胞形態(tài)一致，培養(yǎng)瓶底部細胞達90%融合，呈漩渦狀或輻射狀排列，細胞形態(tài)狹長，核呈橢圓形，進行第1次傳代培養(yǎng)(見圖1B)。隨著傳代次數(shù)增加，細胞不斷增殖分化形成均一的梭形細胞，梭形細胞呈放射狀向周邊生長，即呈典型的極性漩渦狀(見圖1C)。

圖1　BMSC培養(yǎng)結(jié)果(×100)　A　原代3 d　B　原代7 d　C　P3代

2.2 BMSC表面抗原鑒定結(jié)果

經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，經(jīng)培養(yǎng)至第3代細胞的藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標記CD34(Date.07)陽性率為0.61%、PE標記CD45(Date.04)陽性率為0.28%、PE標記CD44(Date.03)陽性率為99.42%、PE標記CD90(Date.02)陽性率為98.69%、空白對照組陽性率為0.45%(Date.01)(見圖2)。

圖2　CD34、CD44、CD45、CD90抗體流式細胞術(shù)檢測結(jié)果

2.3造模期間小鼠DAI評分

空白組小鼠DAI評分在實驗過程中為0；移植組小鼠飲用5%DSS后的第1天和第2天，DAI評分也均為0，第3、4、5、6、7 天的DAI評分依次為(1.06±0.96)、(2.48±1.23)、(4.32±1.43)、(7.26±1.62)、(8.92±1.01)，見圖3。

圖3　移植組小鼠DAI評分

2.4結(jié)腸組織HE染色結(jié)果

移植組飲用DSS 7 d后，結(jié)腸黏膜多處糜爛、潰瘍、出血，黏膜上皮不完整，部分上皮細胞壞死脫落，黏膜層及黏膜下層廣泛充血、水腫，炎性反應(yīng)主要累及黏膜及黏膜下層，浸潤的炎性細胞以中性粒細胞為主；空白組結(jié)腸黏膜上皮完整、連續(xù)，腺體排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)清楚，黏膜層及黏膜下層無異常(見圖4)。

圖4兩組的結(jié)腸組織HE染色結(jié)果A空白組(×100)B移植組(BMSC移植前，×400)

2.5SRY蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，移植組的結(jié)腸組織在移植后3、7、14、21 d均可檢測到SRY蛋白陽性細胞，部分陽性細胞呈簇排列(見圖5)。

圖5移植組的結(jié)腸組織中SRY蛋白陽性細胞檢測結(jié)果(×100)A陽性對照BBMSC移植前C移植后3 dD移植后7 dE移植后14 dF移植后21 d

3討論

3.1BMSC的分離及培養(yǎng)

BMSC是一種具有多向分化潛能的細胞，在特定的條件下能誘導(dǎo)分化形成多種非造血組織細胞(如成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞等)。目前對于BMSC的分離與培養(yǎng)，存在著流式細胞分選法、密度梯度離心法、免疫磁珠法及全骨髓貼壁篩選法等多種方式。全骨髓貼壁篩選法是最早也是較簡單的提取分離方法，有研究表明擴增1代及2代后，BMSC的純度分別達到95%和98%[5]。本實驗采用的是全骨髓貼壁篩選法，獲取的BMSC在培養(yǎng)12 h后即可貼壁，在培養(yǎng)7 d后培養(yǎng)瓶底即有90%融合，表明原代細胞生長旺盛，增殖能力強，可在體內(nèi)快速大量增殖；傳至P3代后BMSC形態(tài)單一均勻，呈典型的極性漩渦狀生長，說明經(jīng)全骨髓培養(yǎng)法所獲取的BMSC純度較高。

3.2BMSC的鑒定

BMSC沒有理想的特異性表面標志物，它既有間質(zhì)細胞的表面抗原，又有內(nèi)皮細胞、上皮細胞及肌肉細胞的表面抗原，包括表達CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD120 a、CD124、CD166等表面抗原[6]，不表達的是造血細胞表面標志物，包括CD14、CD34及白細胞共同抗原CD45等。目前實驗中應(yīng)用的BMSC的表面分子，只是相對接近于BMSC，比如首先排除造血前體細胞標志物抗原CD34，白細胞標志物抗原CD45，以及單核細胞、巨噬細胞表面抗原CD14 等；再檢測BMSC表達陽性的細胞表面標志物，如CD13、CD29、CD44、CD90、CD105。由于沒有特異性的表型，其鑒定尚無統(tǒng)一標準，這給準確鑒定BMSC帶來一定的困難。本實驗利用流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD45、CD34、CD44、CD90抗原的表達率，發(fā)現(xiàn)CD44和CD90表達率>98%，而CD45和CD34表達率<1%，符合BMSC表面抗原表達特征。

3.3UC模型的建立

從20世紀60年代至今，為研究UC，學(xué)者們制作了多種動物模型，如化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型、免疫致敏模型、細胞移植模型和基因敲除模型等[7]。其中化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型的準備方法較為簡單、經(jīng)濟，且在許多方面與人類UC有相似之處。1985年日本學(xué)者首次應(yīng)用DSS制備UC模型，此后大量研究表明DSS誘導(dǎo)的UC模型在臨床表現(xiàn)、腸道病理和發(fā)病機制等方面均與人類UC相似[8]。本實驗采用的是DSS誘導(dǎo)的UC模型，DAI評分隨著飲用DSS時間的延長而升高，與UC急性期主要臨床表現(xiàn)完全相符。飲用DSS 7 d后，遠端結(jié)腸組織HE染色結(jié)果顯示黏膜多處糜爛、潰瘍、出血，黏膜層及黏膜下層充血水腫，炎性細胞浸潤，與Okayasu等[9]的研究結(jié)果一致。結(jié)合制模小鼠臨床病理表現(xiàn)，表明本研究成功復(fù)制了BALB/c小鼠急性UC模型。

3.4BMSC的示蹤

有研究表明，BMSC具有向損傷組織趨化及低免疫原性的特性，可在造血組織以外的多種組織如肺、骨、軟骨、皮膚等處定位和分布，移植后無免疫排斥反應(yīng)[10-11]。為了追蹤移植細胞，必須對細胞進行標記，目前細胞的標記方法主要有熒光染料標記法、抗原標記法、轉(zhuǎn)基因標記法、Y 染色體標記法、磁性標記法等。Y 染色體標記法是將雄性供體動物細胞移植到雌性動物體內(nèi)后，對Y染色體進行檢測，此法不受時間和細胞表型變化的影響，也不受組織類型的限制[12-13]，其穩(wěn)定性及特異性均較高，且可在受體體內(nèi)終生存在，被認為是檢測移植細胞的金標準。本實驗采用的是Y染色體標記法，Y染色體為雄性個體所獨有，所有被分析的哺乳動物的Y染色體上都能找到原始性別決定基因Sry。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測Y染色體上的Sry基因所表達的SRY蛋白，結(jié)果顯示移植組的結(jié)腸組織在BMSC移植后3、7、14、21 d均可檢測到SRY蛋白陽性細胞，表明移植細胞在炎性反應(yīng)等因素的作用下向受損腸道遷移，并可在受損腸道定位成活，這為應(yīng)用BMSC移植治療UC提供了可能。然而，對于移植后定位于受損腸道的干細胞是否有功能、是否發(fā)揮了對腸道的修復(fù)作用以及通過何種途徑發(fā)揮作用，尚需進一步研究。

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(本文編輯：林磊)

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.014

(收稿日期：2015-12-30)