許青青　艾羅燕　吳昌維　蘇大芝　王曉晗　陳志威　江小柯　林　卿　范竹萍

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脂肪變肝細胞中炎性調(diào)節(jié)蛋白A20的表達機制

許青青艾羅燕吳昌維蘇大芝王曉晗陳志威江小柯林卿范竹萍

200001上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院健康保健中心，上海市消化疾病研究所(許青青，艾羅燕，蘇大芝，王曉晗，陳志威，江小柯，范竹萍)；475000開封，河南大學附屬淮河醫(yī)院感染科(吳昌維)；201203桑迪亞醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限責任公司(林卿)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已被認為是一種慢性低度炎性反應(yīng)狀態(tài)[1]，炎性反應(yīng)在其復雜的發(fā)病機制中至關(guān)重要，是疾病向終末期肝病進展的關(guān)鍵。鋅指蛋白A20是由核因子-κB(NF-κB)激活誘導的炎性反應(yīng)負性調(diào)節(jié)蛋白，它通過可逆的去泛素化以及泛素化功能下調(diào)活化的NF-κB信號通路，從而抑制炎性反應(yīng)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，A20對肝臟再生及功能恢復具有積極作用，可抑制肝損傷、肝移植、缺血再灌注等誘發(fā)的炎性反應(yīng)[3-4]，但是否對NAFLD有調(diào)控作用未見報道。前期研究已采用油酸和軟脂酸比為2∶1的混合脂肪酸(FFA)作用HepG2細胞建立脂肪變模型，發(fā)現(xiàn)隨著FFA濃度升高，A20的表達有時間限定性并呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，推測A20可能是通過抑制NF-κB信號通路激活來抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而改善NAFLD[5]，本研究在此基礎(chǔ)上進一步探討A20表達時信號通路的激活情況。

1 材料與方法

1.1材料

肝癌細胞株HepG2由桑迪亞醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限責任公司惠贈。主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶(Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO)、油酸鈉、軟脂酸鈉(Sigma公司)，三酰甘油(TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，RIPA(中)裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗人A20抗體、GAPDH抗體、HRP-偶聯(lián)的羊抗兔IgG(Cell Signaling Technology公司)，ECL化學發(fā)光試劑盒(Perkinelmer公司)，人細胞因子檢測試劑盒(BD公司)。其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及對照組取(3×105～5×105)/mL HepG2細胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液，并按1∶5傳代培養(yǎng)。對照組用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，無混合脂肪酸(FFA)母液。

1.2.2FFA配制分別取304.4 mg油酸和128.2 mg軟脂酸，溶于10 mL甲醇，配成150 mmol/L FFA母液。根據(jù)實驗需要，將母液按比例稀釋成相應(yīng)工作液，DMSO濃度為0.5%。

1.2.3細胞內(nèi)TG含量測定將HepG2細胞按2×105/mL接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，用0.5 mmol/L FFA分別作用于HepG2細胞0、0.25、0.5、1、2、4、6、12、24 h；將6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)液吸出，冰PBS洗滌細胞2次，加入RIPA裂解液30 μL(含蛋白酶抑制劑)，后置于冰上裂解30 min，刮出并轉(zhuǎn)移至Eppendorf管；4 ℃，12 000 rpm離心15 min，小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至Eppendorf管；按照TG試劑盒說明書進行操作，測定細胞內(nèi)的TG含量。

1.2.4細胞內(nèi)蛋白表達檢測將HepG2細胞2×105/mL接種于6孔板，次日加入0.5 mmol/L FFA作用6、12、24 h后，加入細胞裂解液，收取蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，濕法電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到NC膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入A20(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶10 000稀釋)，4 ℃搖床孵育過夜，二抗(1∶20 000稀釋)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光劑顯色后，置暗盒曝光于X膠片上，常規(guī)顯影、定影后，掃描條帶，用Quality One分析軟件半定量結(jié)果，目的蛋白表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.5細胞上清中白細胞介素-8含量測定收集相應(yīng)的細胞上清100 μL，2 mL標準品稀釋液加到標準品中溶解，室溫靜置15 min；制定標準曲線，取6個bead各2 μL/樣品，PE director各12 mL/樣品，兩者振蕩混勻；96孔“V”型板中，加入24 μL上述混合物；加入樣品或各個濃度標準品12 μL/孔，上下吹勻；25 ℃，150 rpm，避光孵育3 h；加入150 μL/孔wash buffer，200 g，離心5 min；甩掉液體，200 μL/孔wash buffer；轉(zhuǎn)移至流式管中，最后流式細胞儀上機操作(按說明書設(shè)立程序進行)。

1.3統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

2.1細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

0.5 mmol/L FFA在0～24 h不同時間點作用于HepG2細胞后，測得細胞內(nèi)TG含量0時為(0.07±0.00)mmol/L，隨著作用時間的延長，從4 h開始增加，12 h到達峰值(0.13±0.00)mmol/L(P<0.05)(見圖1)。

注：與對照組相比較，#P<0.05

圖1細胞內(nèi)TG含量

2.2細胞內(nèi)蛋白表達水平

0.5 mmol/L FFA在0～24 h不同時間點作用于HepG2細胞時，發(fā)現(xiàn)各個時間點A20的表達不同，呈波浪狀起伏，與對照組相比，A20、pIκB在0.25、1、4、6、12 h時表達升高，活化的p65(p65p)在4、6、12 h時表達顯著升高，表明FFA介導NF-κB信號通路活化，A20被誘導呈瞬時表達(見圖2、圖3)。

注：1Da=0.9921 u

圖2HepG2細胞在不同時間點的蛋白A20、p65p、pIκB表達

圖 3　HepG2細胞在不同時間點的蛋白A20、p65p、pIκB半定量結(jié)果

2.3細胞上清中白細胞介素-8含量

0.5 mmol/L FFA在0～24 h不同時間點作用于HepG2細胞時，與對照組(9.57±1.95)相比，在4、6、12、24 h時細胞上清中的白細胞介素-8(IL-8)水平顯著升高[(69.83±3.65)、(95.20±3.95)、(51.34±3.45)、(35.57±3.15) ng/mL](P<0.05)，分泌時相呈先升高后降低趨勢，6 h時為峰值(見圖4)。

注：與對照組相比，#P<0.05

圖4HepG2細胞在不同時間點的細胞上清中IL-8含量

3討論

NAFLD是一種慢性低度炎性反應(yīng)狀態(tài)已成為國際共識，炎性反應(yīng)是其進展的重要原因[6]，這種炎性反應(yīng)不僅可以加重胰島素抵抗，影響營養(yǎng)物質(zhì)代謝，還使得原本靜息的肝星狀細胞活化，促進了肝纖維化、肝硬化的發(fā)生，因此抑制炎性反應(yīng)對阻斷疾病進展具有重要意義。NF-κB通路是此慢性炎性反應(yīng)發(fā)生的主要信號通路[7]，NF-κB是一個異源二聚體蛋白(p50/p65)，在大部分細胞中處于失活狀態(tài)，被其抑制蛋白(IκB)禁錮在細胞質(zhì)中，只有在刺激信號的作用下，IκB在IκB激酶復合體(IKK)的作用下快速發(fā)生磷酸化修飾形成pIκB，而后被26S蛋白酶體降解，從而釋放 NF-κB蛋白，p65p發(fā)生核轉(zhuǎn)移，啟動一系列的炎性反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。鋅指蛋白A20是由NF-κB通路激活誘導的炎性反應(yīng)負性調(diào)節(jié)蛋白，具有雙重泛素編輯酶活性，通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活化，阻斷炎性反應(yīng)持續(xù)發(fā)生及炎性因子表達，從而廣泛參與炎性反應(yīng)及免疫的調(diào)節(jié)[8-9]。那么，A20對NAFLD是否有調(diào)控作用成為本研究最關(guān)心的問題。

本研究通過原先建立的NAFLD細胞模型，在此基礎(chǔ)上進一步利用0.5 mmol/L FFA在不同時間點作用于HepG2細胞，細胞內(nèi)TG含量隨時間延長而增加，細胞上清中IL-8水平在4 h時顯著升高，峰值出現(xiàn)在6 h，其后逐漸降低，呈現(xiàn)脈沖相表達，提示FFA能誘發(fā)脂肪沉積和炎性反應(yīng)。這與以往研究報道一致，如Li等[10]發(fā)現(xiàn)FFA通過作用于Toll樣受體(TLR)內(nèi)源性配體，激活I(lǐng)KK/NF-κB、JNK/AP-1信號通路，誘導NAFLD形成；同樣Joshi-Barve等[11]用軟脂酸刺激肝細胞(HepG2、鼠原代肝細胞、人原代肝細胞)后，NF-κB、JNK/AP-1信號通路激活，IL-8水平升高。此外，本研究觀察到NF-κB信號通路的激活：pIκB和p65p在4、6、12 h時表達顯著升高，IL-8水平亦升高，隨之A20表達升高，并呈波浪樣的改變。這符合A20表達有明顯的時效性特點，只要外界刺激能激活NF-κB，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)與A20啟動子區(qū)的兩個識別序列的κB元件結(jié)合，就能迅速啟動A20基因的轉(zhuǎn)錄，而表達升高是機體的一種重要的內(nèi)源性抗炎保護效應(yīng)機制，可能對于調(diào)控肝內(nèi)慢性低度炎性反應(yīng)具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)高表達A20后，大量參與脂代謝通路的基因和線粒體內(nèi)膜多種調(diào)節(jié)代謝的基因表達上調(diào)，如脂肪酸、氨基酸、膽固醇及類固醇的合成基因表達升高，使脂代謝增強，加快能量輸出，還影響外周脂肪流動、肝內(nèi)脂肪酸攝取，肝細胞內(nèi)TG快速蓄積等代謝過程，說明A20對肝臟的保護作用不僅僅局限于抑制損傷、移植及缺血再灌注所誘發(fā)的炎性反應(yīng)，還具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、產(chǎn)生能量的作用[12]?？梢夾20在肝臟中的多方面作用正被逐漸發(fā)掘和廣泛接受[13]。A20與炎性反應(yīng)、代謝的關(guān)系及機制研究也備受關(guān)注，其在NAFLD疾病發(fā)展中的作用值得深入探討。

本研究在HepG2細胞脂肪變模型中觀察到FFA能誘導NF-κB信號通路激活，IL-8水平升高，A20負反饋表達升高，提示可上調(diào)A20的表達以加強機體固有免疫來發(fā)揮抗炎作用，為NALFD的防治提供可能的有效作用靶點。然而本實驗中A20與NAFLD之間的關(guān)系探討僅局限于細胞水平，更多深入的分子機制以及動物水平的表達規(guī)律有待進一步研究。

志謝感謝桑迪亞醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限責任公司生物部各位老師在操作規(guī)范和實驗技術(shù)上給予的指導

參考文獻

1 Medina-Santillán R, López-Velázquez JA, Chávez-Tapia N, et al. Hepatic manifestations of metabolic syndrome[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2013, Mar 7. [Epub ahead of print]

2 Harhaj EW, Dixit VM. Regulation of NF-κB by deubiquitinases[J]. Immunol Rev, 2012, 246: 107-124.

3 Studer P, da Silva CG, Revuelta Cervantes JM, et al. Significant lethality following liver resection in A20 heterozygous knockout mice uncovers a key role for A20 in liver regeneration[J]. Cell Death Differ, 2015, 22: 2068-2077.

4 da Silva CG, Studer P, Skroch M, et al. A20 promotes liver regeneration by decreasing SOCS3 expression to enhance IL-6/STAT3 proliferative signals[J]. Hepatology, 2013, 57: 2014-2025.

5 許青青, 吳昌維, 艾羅燕, 等. 游離脂肪酸誘導肝細胞脂肪變模型中鋅指蛋白A20的表達及其作用機制[J]. 胃腸病學, 2013, 18: 95-99.

6 Tilg H, Moschen AR. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: the multiple parallel hits hypothesis[J]. Hepatology, 2010, 52: 1836-1846.

7 Marra F. Nuclear factor-kappaB inhibition and non-alcoholic steatohepatitis: inflammation as a target for therapy[J]. Gut, 2008, 57: 570-572.

8 Bhoj VG, Chen ZJ. Ubiquitylation in innate and adaptive immunity[J]. Nature, 2009, 458: 430-437.

9 Sriskantharajah S, Ley SC. Cell biology. Turning off inflammation signaling[J]. Science, 2010, 327: 1093-1094.

10 Li LL, Chen L, Hu L, et al. Nuclear factor high-mobility group box1 mediating the activation of Toll-like receptor 4 signaling in hepatocytes in the early stage of nonalcoholic fatty liver disease in mice[J]. Hepatology, 2011, 54: 1620-1630.

11 Joshi-Barve S, Barve SS, Amancherla K, et al. Palmitic acid induces production of proinflammatory cytokine interleukin-8 from hepatocytes[J]. Hepatology, 2007, 46: 823-830.

12 Damrauer SM, Studer P, da Silva CG, et al. A20 modulates lipid metabolism and energy production to promote liver regeneration[J]. PLoS One, 2011, 6: e17715.

13 da Silva CG, Cervantes JR, Studer P, et al. A20--an omnipotent protein in the liver: prometheus myth resolved [J]. Adv Exp Med Biol, 2014, 809: 117-139.

(本文編輯：林磊)

通信作者：范竹萍，Email: zhuping_fan@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.017

(收稿日期：2015-12-20)