常芳娟 ，趙勁宇，韓巨才，劉慧平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

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丹參內(nèi)生拮抗細(xì)菌DS-9發(fā)酵條件的優(yōu)化

常芳娟 ，趙勁宇，韓巨才，劉慧平*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的]從丹參體內(nèi)分離到一株對(duì)番茄灰霉病菌有較好抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌DS-9，為了更好地發(fā)揮其抑菌活性,[方法]通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法對(duì)其培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NYBD，碳源是葡萄糖，氮源是胰蛋白胨和牛肉膏的組合，最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH 9.0，裝液量為200 mL/500 mL，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為130 r·min-1，時(shí)間為24 h，抑菌物質(zhì)累積量最多，抑菌效果最好。[結(jié)論]通過(guò)該試驗(yàn)為今后丹參內(nèi)生細(xì)菌生物制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：菌體生長(zhǎng)量；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；氮源；碳源；發(fā)酵條件

在其生活史的某一階段或全部階段生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)，對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的細(xì)菌，稱為植物內(nèi)生細(xì)菌[1,2]。植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)被定殖植物有增進(jìn)植物生長(zhǎng)、生物固氮以及防病治病的作用，在一定程度上可以替代農(nóng)藥、化肥的使用，因此對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌的開(kāi)發(fā)是一項(xiàng)很有前途和意義的工程[3～5]。為了最大限度提高內(nèi)生拮抗細(xì)菌抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本，應(yīng)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[6～8]。候美玲等對(duì)1株玉米內(nèi)生枯草芽孢桿菌YY1進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，在發(fā)酵培養(yǎng)30 h時(shí)，抗菌活性幾乎增加至原來(lái)的2倍[9]。洪鵬等研究了解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensHF 01菌株發(fā)酵液對(duì)柑桔綠霉病菌PenicilliumdigitatumSacc的防治效果，優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件后，所得發(fā)酵濾液處理柑橘果實(shí)4 d后，發(fā)病率由 56.7%降低到31.7%，病斑直徑也由48.1 mm顯著降低到25.9 mm，為其后期推廣及產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)[10]。

菌株DS-9是自丹參體內(nèi)分離到的一株拮抗細(xì)菌，前期試驗(yàn)表明其對(duì)多種植物病原菌均有不同程度的抑菌活性，為最大限度的提高菌株抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法對(duì)菌株DS-9的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步提高活性物質(zhì)的比率、降低生產(chǎn)成本，開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥制劑奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

丹參內(nèi)生細(xì)菌DS-9和番茄灰霉病菌(Bortytiscinerea)均為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.1.2培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 000 mL

LB培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL

NYBD培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 000 mL

YSP培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL

CM培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL

PDA培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL

上述培養(yǎng)基的pH用 1 mol·L-1HCl和 1 mol·L-1NaOH 調(diào)節(jié)在7.0～7.3之間。

1.1.3供試碳源

甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、乳糖。

1.1.4供試氮源

酵母膏和蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨、胰蛋白胨和牛肉膏、牛肉膏和酵母膏、胰蛋白胨和酵母膏、蛋白胨[11]。

1.2方法

1.2.1種子液的制備

用接種環(huán)，在酒精燈的外焰部位灼燒滅菌，挑起一環(huán)經(jīng)活化培養(yǎng)48 h的DS-9菌株，將其接種在100 mL/250 mL的LB培養(yǎng)液中，放置于搖床中振蕩，28 ℃，160 r·min-1培養(yǎng)24 h獲得種子發(fā)酵液，備用。

1.2.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

依照1.1.2的各種培養(yǎng)基滅菌后，進(jìn)行接種， 接種量為1%(V/V),每個(gè)處理重復(fù)3次，在28 ℃,160 r·min-1下振蕩培育72 h。之后，觀察不同組分的培養(yǎng)基中DS-9菌液的生長(zhǎng)狀況，并測(cè)定各培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)量和抑菌物質(zhì)的積累量。

1.2.3最佳碳源的篩選

將以上篩選出來(lái)的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，培養(yǎng)基滅菌后，進(jìn)行接種， 接種量為1%(V/V),在28 ℃，160 r·min-1下振蕩培養(yǎng)72 h。每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)定菌體的生長(zhǎng)量和抑菌物質(zhì)的積累量。

1.2.4最佳氮源的篩選

根據(jù)以上步驟選出的適合DS-9生長(zhǎng)的最佳碳源的培養(yǎng)基，將其中的氮源分別換成酵母膏和蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨、胰蛋白胨和牛肉膏、牛肉膏和酵母膏、胰蛋白胨和酵母膏、蛋白胨，培養(yǎng)基滅菌后，進(jìn)行接種， 接種量為1%(V/V),在28 ℃，160 r·min-1下振蕩培養(yǎng)72 h。每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)定菌體的生長(zhǎng)量和抑菌物質(zhì)的積累量。

1.2.5菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定

在30 ℃下，將每次接菌后的培養(yǎng)基放入全能振蕩器中進(jìn)行黑暗振蕩培養(yǎng)，使其菌株能充分發(fā)酵，提高其抗菌活性。用分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值，以相對(duì)應(yīng)的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，每一個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6培養(yǎng)條件的優(yōu)化

試驗(yàn)采用正交法L16(45)(表1)，對(duì)丹參內(nèi)生細(xì)菌DS-9進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)pH，裝液量，接種量，轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，按照已篩選出的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，然后用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，重復(fù)3次。

表1　培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)因素和水平

1.2.7抑菌物質(zhì)積累量的測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法，一定量發(fā)酵液在9 000 r·min-1,離心10 min，取發(fā)酵液上清1 mL與9 mL的PDA培養(yǎng)基充分混勻。冷卻至40 ℃之后，接入直徑為5 mm的番茄灰霉病菌，每個(gè)處理重復(fù)3次。用無(wú)菌發(fā)酵液作為對(duì)照。在25℃下恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照即將長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)定處理組的病斑菌塊直徑/mm，并計(jì)算各處理的抑菌率[12～14]。

抑菌率/%=

2　結(jié)果與分析

2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選

在最適條件下培養(yǎng)72 h后，分別對(duì)發(fā)酵液的菌體生長(zhǎng)量和抑菌物質(zhì)積累量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的OD600，結(jié)果見(jiàn)表2。不同組成成分的培養(yǎng)基，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌DS-9的菌體生長(zhǎng)有顯著影響：其中NYBD培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)量最大，OD600為2.585，其余菌體生長(zhǎng)量的大小(OD600)依次為：2.081(LB培養(yǎng)基)、1.896(YSP培養(yǎng)基)、0.254(CM培養(yǎng)基)、0.217(NB培養(yǎng)基)。其中在以NYBD為培養(yǎng)基時(shí)抑菌物質(zhì)產(chǎn)生量最多，而代謝物對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)抑制作用也最強(qiáng)，抑制率為71.16%。其余培養(yǎng)基中菌體代謝物對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)抑制作用的強(qiáng)弱程度依次為：68.92%(YSP培養(yǎng)基)、43.47%(LB培養(yǎng)基)、42.64%(CM培養(yǎng)基)和39.38%(NB培養(yǎng)基)。綜合菌體生長(zhǎng)量和抗菌物質(zhì)積累量?jī)蓚€(gè)因素考慮，篩選出以NYBD培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

表2不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中DS-9菌體的生長(zhǎng)量和抑菌率

Table 2Basis different medium DS-9 bacteria growth and inhibition rate

基礎(chǔ)培養(yǎng)基BasalmediumOD600值OD600抑菌率/%BacteriostasisrateYSP1.896±0.142b68.92±2.45aNYBD2.585±0.451a71.16±0.56aNB0.217±0.021c39.38±3.48bLB2.081±0.163b43.47±3.74bCM0.254±0.033c42.64±2.28b

2.2最佳碳源篩選

在最適條件下培養(yǎng)72 h之后，觀察可發(fā)現(xiàn)在含有不同碳源的培養(yǎng)基中菌體的生長(zhǎng)情況不同，發(fā)酵液在 24 h、 48 h、 72 h 的 菌體生長(zhǎng)量(OD600)和抑菌物質(zhì)的積累量如表3所示。菌體生長(zhǎng)量方面，以葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基的 OD600在 24 h，48 h和72 h 分別為2.034、2.553、2.716，除在24 h略低于蔗糖和甘露醇外，在48 h和72 h均高于其余碳源菌體生長(zhǎng)量。其中DS-9菌體的生長(zhǎng)量在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的代謝物對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，抑制率為74.47%。其余含有不同碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中菌體代謝物對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)抑制作用差異不大，依次為：69.76%(甘露醇)、65.24%(麥芽糖)、64.41%(淀粉)、63.30%(乳糖)、62.42%(蔗糖)。結(jié)合菌體的生長(zhǎng)量和抑菌物質(zhì)的積累量2個(gè)方面考慮，選擇葡萄糖作為DS-9的最佳碳源。

表3　不同碳源培養(yǎng)基中DS-9菌株的生長(zhǎng)量與抑菌率

2.3最佳氮源篩選

在最適培養(yǎng)條件下，以篩選出來(lái)的葡萄糖為固定碳源，在不同氮源條件下，72 h發(fā)酵培養(yǎng)后，由表4數(shù)據(jù)可知：不同氮源培養(yǎng)基中DS-9菌體的OD600值和抑制率在同一氮源的無(wú)菌濾液中的生長(zhǎng)量隨著時(shí)間的推移在增加。胰蛋白胨和牛肉膏作為氮源時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600為2.585，其余菌體生長(zhǎng)量的大小(OD600)依次為：2.367(牛肉膏和酵母膏)、2.321(酵母膏和蛋白胨)2.286(牛肉膏和蛋白胨)、2.219(胰蛋白胨和酵母膏)、0.859(蛋白胨)。在抑菌物質(zhì)積累量方面，以胰蛋白胨和牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中菌體的代謝物對(duì)番茄灰霉病菌抑制率為81.57%，明顯高于其余5種氮源的78.48%(牛肉膏和酵母膏)、76.42%(酵母膏和蛋白胨)、75.54%(牛肉膏和蛋白胨)、68.73%(蛋白胨)、64.20%(胰蛋白胨和酵母膏)。綜合菌體的生長(zhǎng)量和抑菌物質(zhì)的積累量?jī)蓚€(gè)方面考慮，選取胰蛋白胨+牛肉膏作為 DS-9的最佳氮源。

表4　不同氮源培養(yǎng)基中DS-9菌株的生長(zhǎng)量與抑菌率

2.4培養(yǎng)條件的優(yōu)化

通過(guò)表由極差分析可知(表5)，培養(yǎng)條件的5個(gè)因素最優(yōu)水平組合為A4B4C4D2E1，即丹參內(nèi)生細(xì)菌DS-9最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH為9，裝液量為200 mL/500 mL，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為130 r·min-1，時(shí)間為24 h，所得抑菌物質(zhì)累積量最多，抑菌效果最好。其中，由極差R值可知pH是影響菌株抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的主要因素，其次是發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量和轉(zhuǎn)速。在實(shí)際培養(yǎng)中，確定丹參內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)條件最優(yōu)組合，既要求主要因素一定要選擇最優(yōu)水平，又要求次要因素水平要綜合考慮生產(chǎn)率，成本，勞動(dòng)條件，從而得到最符合生產(chǎn)實(shí)際的最優(yōu)條件。

3　結(jié)論與討論

發(fā)酵是獲得大量抗菌活性物質(zhì)的基礎(chǔ)，而抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量與培養(yǎng)條件，如碳源、氮源、pH以及培養(yǎng)時(shí)間等有著密切關(guān)系，為了能夠更好的發(fā)揮內(nèi)生菌的抑菌活性，并降低實(shí)際生產(chǎn)中的成本。通過(guò)試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，菌株的生長(zhǎng)量越大，培養(yǎng)條件越適合，其培養(yǎng)液的抑菌率越大，即抑菌物質(zhì)的積累也就越多。研究結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌DS-9在NYBD為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖為固定碳源以及以胰蛋白胨和牛肉膏作為氮源的情況下，培養(yǎng)條件為pH為9，裝液量為 200 mL，接種量為 10%，轉(zhuǎn)速為130 r·min-1，時(shí)間為24 h時(shí)菌體生長(zhǎng)量更好，分泌的抗菌物質(zhì)也更多。這與臧超群[13]、劉旭[14]等的研究結(jié)果存在差異,這可能與菌株來(lái)源及宿主植物的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌獨(dú)有的能和植物和諧共處這一特點(diǎn)，可以從生物源尤其是微生物和植物中，尋找出高效無(wú)污染的生物活性物質(zhì)，是開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的一條重要途徑。本試驗(yàn)篩選的丹參內(nèi)生細(xì)菌DS-9對(duì)番茄灰霉病有較好的抑制效果，這對(duì)篩選新的生物農(nóng)藥用于病害防治有很好的應(yīng)用前景。后續(xù)試驗(yàn)還將對(duì)丹參內(nèi)生細(xì)菌DS-9的代謝產(chǎn)物的成分、抑菌機(jī)理以及大田防效進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，以期生防菌DS-9更好的在田間發(fā)揮抑菌作用，并為以后工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

表5　最佳培養(yǎng)條件測(cè)定結(jié)果

注：主次順序：pH(A)>時(shí)間(E)>裝液量(B)>接種量(C)>轉(zhuǎn)速(D)；優(yōu)化組合：A4B4C4D2E1；k1,k2,k3,k4為在1,2,3,4水平下的抑菌率平均數(shù)，R表示極差；不同字母表示新復(fù)極差檢驗(yàn)在0.05水平差異顯著。

Note：Important order: pH(A)>Time(E)>Liquid medium volume(B)>Inoculum density(C)>Rotate speed(D)；Optimization: A4B4C4D2E1；k1, k2,k3, k4 for bacteriostatic rate averages at level 1, 2, 3, 4. R expresses range. Different letters mean significantly different at the level of 0.05 by Duncans test.

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(編輯：張貴森)

收稿日期：2016-03-16 修回日期：2016-04-09

作者簡(jiǎn)介：常芳娟(1991-)，女(漢)，山西晉城人，碩士，研究方向：農(nóng)藥毒理與生物農(nóng)藥 *通訊作者：劉慧平，教授，博士生導(dǎo)師。Tel:0354-6288679; E-mail:sxndlhp@163.com

基金項(xiàng)目：山西省財(cái)政支持農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(SCZZNCGZH201304);山西省財(cái)政支持農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(SCZZNCGZH201403)

中圖分類號(hào)：S43

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)09-0649-05

Optimization of fermentation conditions of an endophytic antifungal bacteria DS-9 isolated from theSalviamiltiorrhiza

Chang Fangjuan, Zhao Jinyu, Han Jucai, Liu Huiping*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:[Objective]The strain DS-9 was an endophyte bacteria from Salvia miltiorrhiza which can good control the Bortytis cinerea. To effectively inhibit pathogenic fungus, [Methods]Its medium composition and fermentation conditions were optimized by the method of single factor and orthogonal design. [Results]The results indicated that the best basic culture medium was NYBD, the optimum carbonsource was glucose, the nitrogen source was the combination of pancreatic peptone and beef extract, the optimum fermentation conditionswere as following: pH 9.0, shaking flask volume at 200 mL/500 mL, proper inoculation 10%, 130 r·min-1for 24 h, the antibacterial substance had higher yield and bacteriostatic effect was the best. [Conclusion]The test for the Salvia miltiorrhiza endophytic bacteria provides the theory basis for the development and application of biological agents.

Key words:Bacteria growth mass; Basal culture medium; Nitrogen source; Carbon source; Fermentation conditions