路蘭紅，李秀清，劉媛媛， 隋月林*，劉建輝，路　寧

(1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室,河北 滄州 061001； 2.河北省滄州市人民醫(yī)院病理科，河北 滄州 061001；3.河北醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2013級，河北 石家莊 050017)

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D-半乳糖對SD大鼠記憶能力及海馬區(qū)γ-氨基丁酸受體1和N-甲基-D-天冬氨酸2B受體表達(dá)的影響

路蘭紅1，李秀清2，劉媛媛1， 隋月林1*，劉建輝1，路寧3

(1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室,河北 滄州 061001； 2.河北省滄州市人民醫(yī)院病理科，河北 滄州 061001；3.河北醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2013級，河北 石家莊 050017)

[摘要]目的觀察注射D-半乳糖后大鼠學(xué)習(xí)記憶變化以及腦海馬γ-氨基丁酸受體1(gamma-aminobutyric acid receptor 1，GABAR1)和N-甲基-D-天冬氨酸2B受體(N-methyl-D-aspartate receptor 2B，NMDAR2B)的表達(dá)變化，探討衰老過程中認(rèn)知水平下降與腦神經(jīng)元可塑性變化的關(guān)系。方法將雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組(10只)，實驗組(20只)。實驗組給予D-半乳糖溶液連續(xù)10周頸背部皮下注射(15 mg·kg-1·d-1)，對照組給予相同劑量的生理鹽水，模型制作完成后進(jìn)行Morris水迷宮實驗，測試結(jié)束后采集大鼠腦組織，采用原位雜交和免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測GABAR1及NMDAR2B基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果實驗組潛伏時間明顯長于對照組，穿越目標(biāo)次數(shù)明顯少于對照組(P<0.05)。NMDAR2B和GABAR1以及NMDAR2B mRNA和GABAR1 mRNA各組大鼠均可見陽性表達(dá)。實驗組NMDAR2B表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄均弱于對照組，而GABAR1表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論在SD大鼠大腦衰老過程中，學(xué)習(xí)記憶下降與大腦海馬區(qū)NMDA和GABA等神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)的變化相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]半乳糖；記憶；衰老；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.003

衰老是一個自發(fā)的必然過程，是機(jī)體自身結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生衰退、適應(yīng)能力和抵抗力下降的過程[1]。作為生物體一種自然現(xiàn)象，衰老可導(dǎo)致組織器官發(fā)生退行性改變，出現(xiàn)機(jī)體功能下降和紊亂。衰老的機(jī)制包括氧自由基學(xué)說、DNA損傷修復(fù)學(xué)說、染色體突變學(xué)說、免疫學(xué)說等。近年來，衰老機(jī)制的研究得到了長足的進(jìn)展，人們對抗衰老的機(jī)制也有了更深層次的認(rèn)識，但至今仍未得到合理的解釋，其中神經(jīng)遞質(zhì)釋放的改變是解釋衰老的機(jī)制之一。本研究借助經(jīng)典皮下注射D-半乳糖致衰老模型[2]，采用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)測試，比較實驗組和對照組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，觀察大鼠認(rèn)知下降與海馬區(qū)γ-氨基丁酸受體1(gamma-aminobutyric acid receptor 1，GABAR1)和N-甲基-D-天冬氨酸2B受體(N-methyl-D-aspartate receptor 2B，NMDAR2B)表達(dá)的變化，探討衰老過程中認(rèn)知水平下降與腦神經(jīng)元可塑性變化的關(guān)系，報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物無特定病原體級雄性SD大鼠30只(北京華阜康)經(jīng)篩選無因視力及無法形成記憶的大鼠，3個月齡，體質(zhì)量200～250 g。大鼠于實驗前進(jìn)行為期5 d的Morris水迷宮訓(xùn)練，隨機(jī)分為對照組(10只)和實驗組(20只)。

1.2實驗材料D-半乳糖、兔抗鼠GABAR1抗體、NMDAR2B抗體、NMDAR2B/GABAR1原位雜交試劑盒、生物素化羊抗兔IgG、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)和二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)均購自Boster公司。

1.3實驗方法

1.3.1模型制作、Morris水迷宮實驗和標(biāo)本制備實驗組連續(xù)10周每日15 mg/kg頸背部皮下注射D-半乳糖溶液，對照組給予等量生理鹽水注射。模型制作完成后，采用Morris水迷宮進(jìn)行定位航行和空間探索實驗。完成水迷宮測試1 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸，暴露心臟，從心尖部插入灌注針至升主動脈，并剪開右心耳形成排出通道，快速灌入37 ℃生理鹽水100～150 mL后，以4 ℃體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，4%多聚甲醛后固定6 h，然后包埋、制成組織切片。

1.3.2免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測NMDAR2B和GABAR1的表達(dá)切片脫蠟至水，血清封閉，室溫20 min，滴加兔抗鼠GABAR1抗體、NMDAR2B抗體，對照實驗用羊血清替代一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗3次；滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3；滴加SABC，37 ℃，20 min，PBS漂洗5 min×3，DAB呈色。終止反應(yīng)后干片，封片。光學(xué)顯微鏡觀察，采用真色彩病理圖像分析系統(tǒng)，定量表達(dá)結(jié)果采用陽性細(xì)胞平均光密度值。

1.3.3原位雜交技術(shù)檢測NMDAR2B和GABAR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄切片脫蠟至水，2%雙氧水室溫20 min，蒸餾水洗滌，3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化60 min以暴露mRNA，20%甘油加入雜交盒保持濕度，加20 μL預(yù)雜交液42 ℃溫箱2 h預(yù)雜交，滴加20 μL雜交液，42 ℃恒溫過夜雜交，SSC緩沖液洗滌，滴加封閉液、生物素化鼠抗地高辛、SABC，DAB呈色。光學(xué)顯微鏡觀察，采用真色彩病理圖像分析系統(tǒng)，定量表達(dá)結(jié)果采用陽性細(xì)胞平均光密度值。

2　結(jié)　　果

2.1Morris水迷宮實驗實驗組定位航行實驗潛伏時間明顯長于對照組，而空間探索實驗穿越目標(biāo)次數(shù)明顯少于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖1。

表12組逃避潛伏期及穿越目標(biāo)次數(shù)比較

組別只數(shù)潛伏期時間(s)穿越目標(biāo)次數(shù)(次)對照組108.85±2.2014.85±2.40實驗組2015.08±2.3611.85±2.12t134.63320.912P0.0000.000

2.2免疫組織化學(xué)檢測NMDAR-2B和GABAR-1表達(dá)的結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果和圖像分析結(jié)果顯示，2組均可見NMDAR2B和GABAR1陽性表達(dá)，細(xì)胞膜被染成黃色。實驗組NMDAR2B表達(dá)弱于對照組，而GABAR1表達(dá)強(qiáng)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖2。

表2　2組GABAR1及NMDAR2B表達(dá)比較

2.3原位雜交技術(shù)檢測NMDAR2B和GABAR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄結(jié)果原位雜交檢測結(jié)果和圖像分析結(jié)果顯示，2組均有NMDAR2B mRNA和GABAR1 mRNA在轉(zhuǎn)錄，陽性結(jié)果呈黃色。實驗組NMDAR2B mRNA表達(dá)弱于對照組，而GABAR1 mRNA表達(dá)強(qiáng)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖3。

表3　2組GABAR-1及NMDA2B mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

3　討　　論

3.1學(xué)習(xí)記憶與衰老研究衰老的動物模型較多，注射D-半乳糖是其中之一，具有耗時短、操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點。其機(jī)制為細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增加，可使半乳糖醇隨之增加，后者可影響細(xì)胞滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和功能障礙等，最終發(fā)生衰老。目前認(rèn)為，學(xué)習(xí)記憶的中樞主要在海馬，學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)是突觸的可塑性改變。神經(jīng)元可塑性的表現(xiàn)形式之一，是中樞興奮性突觸的長時程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)。Morris水迷宮實驗，是英國著名的心理學(xué)家Morris設(shè)計并應(yīng)用于研究腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的一種實驗手段，是神經(jīng)生物學(xué)研究動物空間學(xué)習(xí)、記憶功能常用的行為學(xué)檢測方法，能夠較準(zhǔn)確地反映實驗動物以視覺為基礎(chǔ)的空間學(xué)習(xí)、記憶、定向及定位能力的變化。目前，Morris水迷宮實驗在國內(nèi)外已得到普遍認(rèn)可，如顧平等[3]利用Moris水迷宮檢測了帕金森大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。趙冉冉等[4]測試了癲癇病大鼠的認(rèn)知功能。定位航行實驗主要考察空間學(xué)習(xí)能力，即記憶的獲得鞏固；空間探索實驗的目的是測定觀察對象的空間記憶能力，其存儲信息的機(jī)制主要涉及海馬、紋狀體、基底前腦等邊緣系統(tǒng)及大腦皮層相關(guān)腦區(qū)。潛伏期是檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)[5]。本研究結(jié)果顯示，實驗組SD大鼠定位航行實驗潛伏期明顯長于對照組(P<0.05)，空間探索實驗穿越目標(biāo)次數(shù)明顯少于對照組(P<0.05)。潛伏期延長，表明衰老可使空間定位模糊，學(xué)習(xí)功能減退；穿越目標(biāo)次數(shù)減少，說明衰老也使空間記憶能力下降。與相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果相近[6-7]。

3.2NMDAR2B與衰老NMDAR2B是谷氨酸受體亞型之一。谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，是興奮性遞質(zhì)，約50%的谷氨酸參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的突觸傳遞，幾乎可調(diào)節(jié)正常腦內(nèi)的所有功能，包括學(xué)習(xí)和記憶。谷氨酸受體可分為二大類，離子型受體和代謝型受體。離子型受體可再分為海人藻酸受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體和NMDAR。目前已有多種亞型被鑒定，NMDAR有6種亞型，NMDAR2B是一種分布在海馬內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體。谷氨酸能激活海馬C1區(qū)和齒狀回的NMDAR，從而形成突觸效應(yīng)LTP。LTP與行為相關(guān)的記憶功能有關(guān)，LTP的減少可引起記憶的損傷，LTP的增加可促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶能力[8-11]。使用一定強(qiáng)度和頻率的電刺激，可使NMDAR2B去極化，產(chǎn)生一系列的生化反應(yīng)，最終形成LTP，而LTP又可促進(jìn)NMDAR2B的表達(dá)。LTP的產(chǎn)生與NMDAR2B電壓依賴的Mg2+阻斷特性有關(guān)。Miyashita等[12]研究發(fā)現(xiàn)在長時程記憶形成中Mg2+對NMDAR2B的阻斷是必需的，Mg2+濃度的提高增加了GluN2B的表達(dá)量，GluN2B的增加能夠增強(qiáng)NMDAR2B依賴的LTP[13]，提高學(xué)習(xí)記憶能力。LTP能夠誘導(dǎo)NMDAR2B與CaMKⅡ形成更多的復(fù)合物，CaMKⅡ/NMDAR2B復(fù)合物被認(rèn)為是一種記憶分子，對突觸功能的維持有重要作用[14]。本研究實驗組SD大鼠NMDAR2B及NMDAR2B mRNA的表達(dá)都弱于對照組，NMDAR2B及NMDAR2B mRNA表達(dá)下調(diào)，使LTP減弱，從而影響了學(xué)習(xí)和記憶功能。有文獻(xiàn)報道，老年大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力均顯著下降(P<0.01)，海馬神經(jīng)可塑性蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)[15]。

本研究結(jié)果顯示，在給予D-半乳糖皮下注射10周后，實驗大鼠表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降趨勢，Morris水迷宮實驗顯示大鼠的逃避潛伏時間明顯延長，穿越目標(biāo)次數(shù)明顯減少；海馬區(qū)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)NMDAR2B表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABAR1表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。提示在SD大鼠的大腦衰老過程中，其學(xué)習(xí)記憶下降與大腦海馬區(qū)NMDA和GABA等神經(jīng)遞質(zhì)的受體表達(dá)變化有關(guān)。但是，如何減輕衰老過程中神經(jīng)細(xì)胞功能的減退，延緩衰老進(jìn)程，預(yù)防老年癡呆癥的發(fā)生，仍是亟待深入研究的一個課題。(本文圖見封三)

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(本文編輯：許卓文)

[收稿日期]2016-01-12；[修回日期]2016-02-01

[作者簡介]路蘭紅(1966-)，男，河北海興人，滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校副教授，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事人體解剖學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究。 *通訊作者。E-mail：suiyuelin@sina.com

[中圖分類號]R338.64

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)05-0506-05

Effects of D-galactose on cognitive quality and expression of GABAR1 and NMDAR2B in hippocampus in SD rats

LU Lan-hong1, LI Xiu-qing2, LIU Yuan-yuan1, SUI Yue-lin1*, LIU Jian-hui1, LU Ning3

(1.Department of Anatomy, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, China; 2.Department of Pathology, people's Hospital of Cangzhou City, Hebei Province, Cangzhou 061001, China;3.Grade 2013 of Clinical Medicing, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

【Abstract】ObjectiveTo explor the effects of D-galactose on the cognitive quality decline and the neuronal plasticity in the process of aging by observing the changes of learning and memory quality and the expression of gamma-aminobutyric acid receptor 1(GABAR1) and N-methyl-D-aspartate receptor 2B(NMDAR2B) in rats. MethodsMale SD rats were randomly divided into experimental group(10) and control group(20). D-galactose (15 mg·kg-1·d-1) was subcutaneously injected for 10 weeks in experimental group and the same dose of physiological saline was given to control group. Morris water maze test was performed after model prepared. Then the brain tissue was collected and the mRNA transcription and protein expression of GABAR1 and NMDAR2B were detected by in situ hybridization and immunohistochemistry methods. ResultsThe latency was significantly longer and the frequency of passing through the target was significantly less in experimental group than those in the control group(P<0.05). GABAR1 and NMDAR2B were positively expressed at the mRNA and protein level in each group. The protein expression and mRNA transcription of NMDAR2B in experimental group were weaker than those in the control group. But the protein expression and mRNA transcription of GABAR1 were higher in experiment group than in control group，the difference was statistically significant(P<0.05). ConclusionThe learning and memory quality decline were related to the expression change of neurotransmitter receptors such as NMDAR2B and GABAR1 in hippocampus in the brain aging process of SD rats.

[Key words]galactose; memory; aging; rats