劉艷雙，郭　煒

(1.河北省永清縣人民醫(yī)院兒科，河北 永清 065600；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與藥事管理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

?

高效液相色譜法研究大鼠肝微粒體中布地奈德異構(gòu)體的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

劉艷雙1，郭煒2*

(1.河北省永清縣人民醫(yī)院兒科，河北 永清 065600；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與藥事管理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

[摘要]目的研究布地奈德2個(gè)差向異構(gòu)體在大鼠肝微粒體孵育體系中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。方法超速離心法制備大鼠肝微粒體，采用高效液相色譜法測(cè)定布地奈德2個(gè)差向異構(gòu)體在大鼠肝微粒體孵育體系中的濃度。結(jié)果布地奈德與大鼠肝微粒體孵育后，2個(gè)差向異構(gòu)體的代謝存在差異，在孵育初期或微粒體酶濃度較低時(shí)，22R-布地奈德的代謝較快，隨著孵育時(shí)間的延長或微粒體酶濃度的增加，22S-布地奈德的代謝明顯多于22R-布地奈德；22S-布地奈德的Km、Vmax約為22R-布地奈德的2倍。結(jié)論 布地奈德差向異構(gòu)體的這種代謝差異與22R-布地奈德的親和力較高(Km小于22S-布地奈德)、Vmax值較小有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]布地奈德；微粒體，肝；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.016

布地奈德(budesonide)是一種具有高效局部抗炎作用的糖皮質(zhì)激素[1-2]，由于其顯著的首過效應(yīng)，多以呼吸道給藥的形式治療哮喘[3]、佐治肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病(商品名：普米克)[4-8]。然而即使采用吸入的方式給藥，布地奈德也會(huì)通過口咽部、氣道的黏膜吸收，通過吞咽經(jīng)胃腸道吸收從而發(fā)揮全身作用，如長期大劑量吸入給藥導(dǎo)致的皮膚變薄、白內(nèi)障、發(fā)育遲緩、骨流失和下丘腦-垂體-腎上腺軸抑制等作用。因此，有必要研究布地奈德進(jìn)入體循環(huán)后的代謝排泄過程。臨床上應(yīng)用的布地奈德是其22R和22S差向異構(gòu)體1∶1組成的混合物，且22R的活性較22S強(qiáng)2～3倍[9]。已有研究報(bào)道，布地奈德主要經(jīng)肝臟代謝[特別是細(xì)胞色素P4503A(CYP3A)]，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，主要有6β-hydroxy-budesonide、16α-hydroxy-prednisolone，以及經(jīng)過脂化酶催化產(chǎn)生一些列與脂肪酸酯化的產(chǎn)物[10]。但目前并不清楚給予布地奈德后，2個(gè)差向異構(gòu)體在肝微粒體的代謝速率及酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)是否有差異。本研究采用體外大鼠肝微粒體孵育，用高效液相色譜法高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)布地奈德2個(gè)差向異構(gòu)體的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配備有四元溶劑輸送系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和VWD檢測(cè)器)，配有Chemstation色譜工作站；CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)；KQ-300DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Optima L-100 XP超速離心機(jī)(美國Beckman-Coulter公司)。布地奈德對(duì)照品(HPLC純度99.4%，批號(hào)：100989-200801)、曲安奈德對(duì)照品(HPLC純度98.8%，批號(hào)：100055-201103)購于中國食品藥品檢定研究院；氧化型輔酶Ⅱ(beta-nicotinamide adenine dinucleotide phophate Ⅱ，β-NADP)、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶均為Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純，水為自制重蒸水，其他試劑均為分析純。雄性SD大鼠(體質(zhì)量230～260 g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。BCA試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，中國杭州)。

1.2溶液配制布地奈德對(duì)照溶液：精密稱取布地奈德對(duì)照品適量，用甲醇溶解并制成0.5 g/L的貯備液；精密量取適量，用4%甲醇稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L的系列濃度對(duì)照溶液，備用。內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取曲安奈德對(duì)照品3.29 mg，用甲醇溶解并制成0.329 mg/L的溶液。

1.3色譜條件色譜柱：Symmetry C18柱(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(35∶65)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長：244 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4肝微粒體的制備[11]取雄性SD大鼠5只，禁食12 h后斷頭處死，開腹迅速取出肝臟，用濾紙吸干后稱質(zhì)量，然后置于冰Tris-HCl緩沖液中清洗，剪碎，洗至無色，加4倍質(zhì)量的Tris-HCl緩沖液于冰浴中研磨勻漿。冰浴超聲分散60 s，4 ℃低溫離心(20 000×g)20 min，棄沉淀，取上清液4 ℃超速離心(100 000×g)60 min，棄上清，用Tris-HCl緩沖液清洗沉淀，并再次超速離心(100 000×g)60 min，所得沉淀即為肝微粒體。用適量Tris-HCl緩沖液懸浮沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5肝微粒體蛋白濃度測(cè)定

1.5.1溶液的配制BCA工作液的配制：按需用量配制適量的BCA工作液，BCA試劑A與BCA試劑B按體積比50∶1混合，充分混勻。牛血清白蛋白儲(chǔ)備液的配制：取 BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白(2 mg/mL)0.5 mL，用蒸餾水稀釋并定容至10 mL，最終BSA濃度為100 mg/L。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密量取上述儲(chǔ)備液，用蒸餾水配制成0、20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備分別取不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL，置于1.5 mL離心管(每管均作復(fù)管對(duì)照)，每管分別加入BCA工作液1 mL，立刻渦旋30 s。放置37 ℃反應(yīng)30 min，將蛋白濃度為0作為空白對(duì)照溶液，試管恢復(fù)至室溫，采用分光光度計(jì)于562 nm波長測(cè)定吸光度，以吸光度A為橫坐標(biāo)，以蛋白濃度C為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線回歸，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線C=0.001 2A+0.051 1(r=0.997 8)。

1.5.3肝微粒體蛋白濃度的測(cè)定將制備的肝微粒體樣品用Tris-HCl溶液稀釋100倍(取微粒體100 μL用Tris-HCl溶液定容至10 mL，混勻)，取50 μL依標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定吸收度，以同體積的Tris-HCL緩沖液代替肝微粒體樣品同上處理后作為空白對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度，測(cè)得肝微粒體懸浮液的蛋白濃度為5.1 mg/mL。

1.6溫孵過程及樣品處理參考文獻(xiàn)[11-12]條件，反應(yīng)體系(200 μL，用Tris-HCl緩沖液溶解稀釋)中含微粒體再生體系(β-NADP 0.5 mmol/L、葡萄糖-6-磷酸 5.0 mmol/L、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1.0 U/mL)，肝微粒體蛋白0.3 mg/mL。37 ℃水浴振蕩(150 r/min)一定時(shí)間后，立即加入含有內(nèi)標(biāo)的冰甲醇溶液400 μL，渦旋2 min，終止反應(yīng)，10 000 g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，每個(gè)樣品平行溫孵3份。并用滅活的微粒體(80 ℃水浴振蕩10 min)做相應(yīng)的對(duì)照溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)做不含微粒體、不含微粒體再生體系的空白對(duì)照。每個(gè)反應(yīng)體系中甲醇的終濃度<1%。

2　結(jié)　　果

2.1方法學(xué)考察布地奈德對(duì)流動(dòng)相的酸堿變化不敏感，在乙腈-水(35∶65)的體系下可以實(shí)現(xiàn)其2個(gè)差向異構(gòu)體的基線分離，分離度為1.8(見圖1)。結(jié)合文獻(xiàn)[13]報(bào)道的出峰順序，保留時(shí)間5.19 min和5.60 min的峰分別為22R-布地奈德及22S-布地奈德。由圖1可見，大鼠微粒體及再生體系均不影響布地奈德的測(cè)定，專屬性良好。22R-布地奈德及22S-布地奈德在1.57～50.30 μmol/L的范圍內(nèi)的回歸方程分別為Y=980 737X-0.043 9(r=0.999 9)和Y=738 975X-0.074 3(r=0.999 9)，線性關(guān)系良好。連續(xù)測(cè)定3日，其日內(nèi)日間精密度均<15%。因此，本法可以用來測(cè)定布地奈德在大鼠微粒體中的濃度。

圖1HPLC色譜圖

A.不含藥物及內(nèi)標(biāo)的微粒體體系；B.0.8 μmol/L布地奈德孵育0 min的微粒體體系；C.0.8 μmol/L布地奈德孵育15 min的微粒體體系；1：內(nèi)標(biāo)曲安奈德；2：22R-布地奈德；3：22S-布地奈德

Figure 1The HPLC chromatograms

2.2在大鼠肝微粒體中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

2.2.1孵育時(shí)間對(duì)布地奈德代謝速率的影響在上述溫孵系統(tǒng)條件下，0.8 μmol/L的布地奈德在大鼠肝微粒體蛋白濃度為0.4 mg/L的體系中，經(jīng)37 ℃溫孵振蕩5～30 min，以布地奈德的相對(duì)剩余濃度-時(shí)間作圖(圖2A)。由圖2A可見，22R-布地奈德及22S-布地奈德在5～15 min呈線性消除，在15～30 min內(nèi)二者的消除速度均減慢，因此溫孵最佳時(shí)間選擇為15 min。以孵育時(shí)間和22R-布地奈德與22S-布地奈德相對(duì)剩余濃度的比值作圖(圖2B)，發(fā)現(xiàn)二者的比值從0 min的1.34降到10 min的1.29，然后增加到1.79，呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。

圖2孵育時(shí)間對(duì)布地奈德差向異構(gòu)體代謝速率的影響

A.布地奈德差向異構(gòu)體的相對(duì)剩余濃度；B.22R-與22S-布地奈德相對(duì)剩余濃度的比值

Figure 2The effects of incubation time on the metabolic rate of epimeric isomers of budesonide

2.2.2大鼠肝微粒體蛋白濃度對(duì)布地奈德代謝速率的影響在上述溫孵系統(tǒng)條件下，0.8 μmol/L的布地奈德在大鼠肝微粒體濃度為0.05～0.40 mg/mL的體系中，孵育15 min，以布地奈德的相對(duì)剩余濃度-時(shí)間作圖(圖3A)。由圖3A可見，22R-布地奈德及22S-布地奈德在微粒體濃度0.1～0.4 mg/mL的范圍內(nèi)呈線性消除，為減少藥物與蛋白的結(jié)合，并使藥物的代謝率約為20%，故確定最佳的微粒體蛋白濃度為0.3 mg/mL。以微粒體濃度和22R-布地奈德與22S-布地奈德相對(duì)剩余濃度的比值作圖(圖3B)，發(fā)現(xiàn)二者的比值同樣呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。

圖3大鼠肝微粒體濃度對(duì)布地奈德差向異構(gòu)體代謝速率的影響

A.布地奈德差向異構(gòu)體的相對(duì)剩余濃度；B.22R-布地奈德與22S-布地奈德相對(duì)剩余濃度的比值

Figure 3The effects of microsomal enzyme concentration on the metabolic rate of epimeric isomers of budesonide

2.2.3底物濃度對(duì)布地奈德代謝速率的影響在上述溫孵系統(tǒng)條件下，不同濃度的布地奈德溶液在肝微粒體蛋白濃度為0.3 mg/mL時(shí)，孵育15 min。以溫孵液中布地奈德濃度的減少量(μmol/L)除以溫孵時(shí)間(min)及蛋白濃度表示布地奈德的代謝速率V，[S]表示底物濃度，根據(jù)Eadie-Hofstee方程V=Vmax-KmV/[S]，Vmax表示最大反應(yīng)速率，Km表示米氏常數(shù)，利用GraphPad Prism 5.00 Software (GraphPad Software Inc,San Diego, CA, USA)進(jìn)行非線性回歸(圖4)。計(jì)算得22R-布地奈德的Vmax=4.4 μmol·L-1·min-1·mg-1，Km=1.6 μmol·min-1·mg-1，肝內(nèi)清除率=Vmax/Km=2.7 L·min-1·mg-1；22S-布地奈德的Vmax=8.5 μmol·L-1·min-1·mg-1，Km=2.7 μmol·min-1·mg-1，肝內(nèi)清除率=3.1 L·min-1·mg-1。22S-布地奈德的Km、Vmax約為22R-布地奈德的2倍。

圖4底物濃度對(duì)布地奈德差向異構(gòu)體代謝速率的影響

A.22R-布地奈德；B.22S-布地奈德

Figure 4The effects of substrate concentration on the metabolic rate of epimeric isomers of budesonide

3　討　　論

藥物經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化有利于其從體內(nèi)的排出，肝臟中的微粒體酶在藥物代謝中起到了重要作用，故常用肝微粒體酶的體外孵育法來研究藥物的代謝[14-15]。通過肝微粒體溫孵實(shí)驗(yàn)，計(jì)算藥物在生物轉(zhuǎn)化過程中的主要酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km和Vmax)，可闡明藥物的代謝機(jī)制[16-17]。布地奈德在肝臟中代謝廣泛，生成多種代謝產(chǎn)物，測(cè)定每個(gè)產(chǎn)物生成的酶動(dòng)力參數(shù)非常復(fù)雜，需要代謝產(chǎn)物的對(duì)照品，而且不能從整體上反映布地奈德的酶動(dòng)力學(xué)特征，因此本研究以布地奈德底物的消除來計(jì)算布地奈德的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

臨床上使用的布地奈德是22R-布地奈德和22S-布地奈德的混合物[18-19]，因此，本研究也用其混合物作為底物進(jìn)行孵育反應(yīng)，然后用HPLC分離測(cè)定孵育體系中布地奈德的2個(gè)差向異構(gòu)體的濃度。通過計(jì)算布地奈德2個(gè)差向異構(gòu)體的肝內(nèi)清除率，表明布地奈德是一個(gè)肝代謝藥物，且代謝較快，另外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，布地奈德2個(gè)差向異構(gòu)體的肝微粒體代謝依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。

研究布地奈德在大鼠肝微粒體的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)其差向異構(gòu)體代謝速度存在差異，在孵育初期或微粒體酶濃度較低時(shí)，22R-布地奈德的代謝較多，表現(xiàn)在22R-布地奈德與22S-布地奈德剩余濃度的比值降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)22R-布地奈德的Km值小于22S-布地奈德，說明22R-布地奈德與藥物代謝酶的親和力較高，是致使其代謝較快的原因；相

反，在孵育后期或微粒體酶濃度較高時(shí)，22S-布地奈德代謝較多，故22R-布地奈德與22S-布地奈德剩余濃度的比值增加，這與22S-布地奈德的Vmax、肝內(nèi)清除率大于22R-布地奈德有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]馬兆越，林榮軍.吸入性糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘患兒血清1,25-(OH)2 D3、皮質(zhì)醇及促腎上腺皮質(zhì)激素水平的影響[J].兒科藥學(xué)雜志，2015，21(4)：1-3.

[2]劉琦，梁翠榮，謝元超，等.HPLC法測(cè)定布地奈德氣霧劑的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2014，34(3)：471-474.

[3]李華文.孟魯司特聯(lián)合布地奈德治療兒童哮喘的療效分析[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(11)：1320-1322.

[4]羅燕萍，梁景林.布地奈德聯(lián)合特布他林佐治小兒毛細(xì)支氣管炎[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19(1)：143-144.

[5]艾尼瓦爾·那斯肉拉，魏雪梅，楊曉紅，等.布地奈德和沙丁胺醇霧化吸入治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的療效觀察[J].臨床薈萃，2012，27(20)：1804-1806.

[6]沈玉祥.布地奈德聯(lián)合鹽酸氨溴索霧化吸入對(duì)小兒支氣管肺炎的療效分析[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(6)：712-714.

[7]段世玲.空氣壓縮泵霧化吸入普米克令舒治療小兒急性感染性喉炎的療效觀察[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34(1)：75-76.

[8]劉小娟.普米克令舒吸入佐治小兒毛細(xì)支氣管炎療效觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2015,7(4):344-345.

[9]Matabosch X,Pozo OJ,Pérez-MaC,et al. Identification of budesonide metabolites in human urine after oral administration[J]. Anal Bioanal Chem,2012,404(2):325-340.

[10]Seideg?rd J,Nyberg L,Borg? O. Differentiating mucosal and hepatic metabolism of budesonide by local pretreatment with increasing doses of ketoconazole in the proximal jejunum[J]. Eur J Pharm Sci,2012,46(5):530-536.

[11]張慧霞，王鑫，劉有平，等.白屈菜堿在大鼠肝微粒體中代謝的酶動(dòng)力學(xué)及CYP450酶特異性抑制劑對(duì)其代謝的影響[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，32(4)：276-280.

[12]馮素香，王蒙蒙，吳兆宇，等.大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中的代謝及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2015，36(5)：383-391.

[13]Lu Y,Sun Z,Zhang Y,et al. Simultaneous quantification of 22R and 22S epimers of budesonide in human plasma by ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry:application in a stereoselective pharmacokinetic study[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013,921/922:27-34.

[14]張振清.我國藥物代謝與藥代動(dòng)力學(xué)學(xué)科發(fā)展與展望[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2015，29(5)：752-754.

[15]張帥，郭魏魏，申雷.藥物代謝在藥品開發(fā)中的作用[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8(23)：209-210.

[16]賈佩佩，張曉旭，張智勇，等.染料木苷在大鼠肝微粒體中的代謝及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2015，50(9)：797-801.

[17]邢曉丹.鉤吻素子在大鼠肝微粒體中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[J].海峽藥學(xué)，2013，25(8)：33-36.

[18]Dignass A,Stoynov S,Dorofeyev A E,et al. Once versus three times daily dosing of oral budesonide for active Crohn's disease:a double-blind,double-dummy,randomised trial [J]. J Crohns Colitis,2014,8(9):970-980.

[19]Thulesiu HL,Cervin A,Tessen M. Trentment with a topical glucocorticoid,budesonide reduced the variability of rhinomanometric nasal airway resistance[J]. Rhinology,2014,52(1):19-24.

(本文編輯：劉斯靜)

[收稿日期]2015-12-04；[修回日期]2015-12-27

[基金項(xiàng)目]廊坊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(2014013055)

[作者簡介]劉艷雙(1977-)，女，河北永清人，河北省永清縣人民醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事兒科疾病診治研究。 *通訊作者。E-mail:guowei8043586@sina.com

[中圖分類號(hào)]R969.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)05-0558-05

Study on the enzymatic reaction kinetics of epimeric isomers of budesonide in rat liver microsomes by HPLC

LIU Yan-shuang1, GUO Wei2

(1.Department of Paediatrics, People's Hospital of Yongqing County, Hebei, Langfang 065600;2.Department of Clinical Pharmacy and Pharmacy Administration Science, School of Pharmacy, Hebei Medical University, Hebei, Shijiazhuang, 050017)

【Abstract】ObjectiveTo identify the differences of the enzymatic reaction kinetics of two epimeric isomers of budesonide in rat liver microsomes.MethodsThe rat liver microsomes(RLM) was prepared by ultracentrifugation, and the concentration of epimeric isomers of budesonide co-incubated with RLM were determined by high performance liquid chromatography. ResultsThe metabolic differences of two isomers of budesonide were observed after budesonide incubated with RLM. The metabolism of 22R-budesonide was faster than that of 22S-isomer in the early stage of incubations or at low concentration of microsomal enzyme used. However, with the prolongation of incubation time or increased concentration of microsomal enzyme, the metabolism of 22S-budesonide was obviously faster than 22R-isomer. The values for Km and Vmaxof 22R-budesonide were about 2 times greater than those of the epimer(22S). ConclusionThe higher affinity for 22R-budesonide and with a small value of Vmax, was the main reason for the presented metabolic profile of epimeric isomers of budesonide.

[Key words]budesonide； microsomes, liver； rats