陸曉華，鄭亞莉，張 霞，李 博，保 莉，羅紅艷，曹 麗，鄂 靜，張 彬，畢逢辰

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·論著·

周期素依賴性蛋白激酶5過度活性與腎小球足細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究

陸曉華，鄭亞莉，張 霞，李 博，保 莉，羅紅艷，曹 麗，鄂 靜，張 彬，畢逢辰

目的通過在腎小球足細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p25基因，探討周期素依賴性蛋白激酶5(Cdk5)的活性對足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的影響。方法2014年度，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)分化成熟的小鼠離體足細(xì)胞，將足細(xì)胞分為對照組、空轉(zhuǎn)染組和p25轉(zhuǎn)染組。應(yīng)用pAdTrack-CMV病毒載體克隆p25基因，并轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，48 h收集細(xì)胞；采用Western blotting法測定Cdk5、p25、p35及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3的表達(dá)水平；應(yīng)用免疫沉淀和同位素γ-32P標(biāo)記法測定Cdk5活性；足細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色，觀察Cdk5、p35在足細(xì)胞中的表達(dá)，以及足細(xì)胞Actin的排列情況。結(jié)果HEK293細(xì)胞Cdk5表達(dá)陽性，p35表達(dá)陰性，腎臟皮質(zhì)、足細(xì)胞和腎小球中均有不同程度的Cdk5和p35的表達(dá)。對照組和空轉(zhuǎn)染組p25表達(dá)陰性，p25轉(zhuǎn)染組p25表達(dá)陽性。各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3表達(dá)水平和Cdk5活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中p25轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3表達(dá)水平和Cdk5活性高于對照組和空轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。p25轉(zhuǎn)染組足細(xì)胞內(nèi)Actin排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常改變，對照組和空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Actin排列正常，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變。結(jié)論p25引起Cdk5過度活性可致腎小球足細(xì)胞形態(tài)改變，Actin排列紊亂，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，Cdk5的活性在維持足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用。

足細(xì)胞；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶5；p35；p25；細(xì)胞凋亡

陸曉華，鄭亞莉，張霞，等.周期素依賴性蛋白激酶5過度活性與腎小球足細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(23)：2793-2797.[www.chinagp.net]

LU X H,ZHENG Y L,ZHANG X,et al.Relationship between overactivation of Cdk5 and the glomerulus podocyte apoptosis[J].Chinese General Practice，2016，19(23)：2793-2797.

周期素依賴性蛋白激酶5(Cdk5)與其激活蛋白p35結(jié)合形成Cdk5/p35復(fù)合物，其活性與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在某些病理因素下，p35被水解形成活性更高的p25。Cdk5/p25具有神經(jīng)毒性，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，引起神經(jīng)退行性病變[1]。目前發(fā)現(xiàn)，Cdk5和p35也存在于腎小球足細(xì)胞，并具有維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的作用。正常足細(xì)胞中是否存在p25，以及Cdk5的過度激活復(fù)合物Cdk5/p25是否引起足細(xì)胞損害尚不明確。本研究通過在足細(xì)胞中過度表達(dá)p25，觀察Cdk5/p25活性對足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1　材料與方法

1.1抗體和試劑分化成熟的小鼠離體腎臟皮質(zhì)、足細(xì)胞和腎小球標(biāo)本(美國國立衛(wèi)生研究院，國家糖尿病、消化系統(tǒng)病和腎病研究所Dr.Jeffrey Kopp實(shí)驗(yàn)室提供)，HEK293細(xì)胞(美國Cayman公司)，抗Cdk5抗體(1∶1 000或1∶100)、抗p35抗體(1∶1 000或1∶100)、抗WT1抗體(1∶2 500，美國Santa Cruz公司)，抗Cleaved caspase3抗體(1∶1 000，美國Cell Signaling Technology)，抗Tubulin抗體和抗β-actin抗體(1∶3 000或1∶500，美國Sigma公司)，Roscovitine(美國ChEMBL公司)，Lipofectamin 2000基因轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)液(美國Invitrogen生命技術(shù)公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及分組2014年度，參考文獻(xiàn)[2]體外培養(yǎng)分化成熟的小鼠離體足細(xì)胞,將細(xì)胞培養(yǎng)在膠原Ⅰ涂層的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640，加入2 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES液，1 mmol/L丙戊酸鈉，100 U/ml青霉素和鏈霉素。將細(xì)胞放置33 ℃孵育箱，并在培養(yǎng)液中加10 U/ml重組鼠γ-interferon誘發(fā)細(xì)胞增生。將細(xì)胞鋪板，放置到37 ℃,5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)10～14 d，使細(xì)胞分化。將細(xì)胞分為對照組、空轉(zhuǎn)染組和p25轉(zhuǎn)染組。

1.2.2p25基因轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)并合成p25引物[3],PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序分析正常后，將擴(kuò)增產(chǎn)物和腺病毒質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV用限制性酶NotI和ECORV酶切，從DNA膠里提取線性片段，將兩者混合后，37 ℃水浴 2 h，加入 DNA連接酶，獲得含有p25靶基因病毒質(zhì)粒。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞內(nèi),繁殖48 h后收取病毒，純化并滴定最佳的轉(zhuǎn)染濃度。將足細(xì)胞鋪板于6-well培養(yǎng)盤，使其分化10 d后轉(zhuǎn)染空載體或攜帶有p25基因的腺病毒(1 μl/ml)，48 h后收取足細(xì)胞。

1.2.3Cdk5、p25、p35及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3的表達(dá)采用Western blotting法測定Cdk5、p25、p35及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3的表達(dá)水平，將提取的蛋白上樣到4%～20%的聚丙烯酰胺凝膠上，電泳分離，轉(zhuǎn)膜(100 V,90 min)。用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h；加入一抗(用封閉液稀釋)，4 ℃孵育過夜；漂洗后與山羊抗鼠或山羊抗兔的IgG(H+L)-HRP共軛二抗(1∶2 500)室溫下孵育 1～2 h；X線底片曝光，定性分析Cdk5、p35在HEK293細(xì)胞、腎臟皮質(zhì)、足細(xì)胞、腎小球，以及Cdk5、p25和p35在不同轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)；以光密度值反映細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Cdk5活性應(yīng)用免疫沉淀和同位素γ-32P標(biāo)記法測定Cdk5活性，裂解細(xì)胞，提取蛋白，蛋白質(zhì)比色定量分析(BCA法)進(jìn)行蛋白定量分析。取300 μg蛋白加Cdk5多克隆抗體(1∶20)，4 ℃孵育過夜，次日加IgA瓊脂糖凝膠珠4 ℃孵育4 h，用細(xì)胞溶解液洗滌3次，用同位素γ-32P標(biāo)記法測定Cdk5活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5免疫熒光化學(xué)染色4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液封閉30 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日用PBS洗滌3次,加入二抗，室溫孵育1 h，再用PBS洗滌3次，細(xì)胞核用DAPI染色5 min，加蓋載玻片。采用Zeiss LSM-510激光掃描共聚焦顯微鏡采集熒光圖像，觀察Cdk5、p35在足細(xì)胞中的表達(dá)，以及足細(xì)胞Actin的排列情況。

2　結(jié)果

2.1Cdk5、p25、p35的表達(dá)HEK293細(xì)胞Cdk5表達(dá)陽性，p35表達(dá)陰性，腎臟皮質(zhì)、足細(xì)胞和腎小球中均有不同程度的Cdk5和p35的表達(dá)(見圖1)。免疫熒光化學(xué)染色顯示，足細(xì)胞Cdk5和p35表達(dá)陽性(見圖2，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。對照組和空轉(zhuǎn)染組p25表達(dá)陰性，p25轉(zhuǎn)染組p25表達(dá)陽性(見圖3)。

注：1為HEK293細(xì)胞，2為腎臟皮質(zhì)，3為足細(xì)胞，4為腎小球；Cdk5=周期素依賴性蛋白激酶5

圖1Western blotting法測定Cdk5和p35的表達(dá)

Figure 1The expression of Cdk5 and p35 detected by Western blotting

注：a示Cdk5在足細(xì)胞表達(dá)，b示p35在足細(xì)胞表達(dá)，c示足細(xì)胞核染色，d示重疊

圖2免疫熒光染色測定Cdk5和p35在足細(xì)胞中的表達(dá)(×400)

Figure 2The expression of Cdk5 and p35 in podocyte determined by immunofluorescence staining

2.2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3的表達(dá)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3表達(dá)水平和Cdk5活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中p25轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3表達(dá)水平和Cdk5活性高于對照組和空轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變p25轉(zhuǎn)染組足細(xì)胞內(nèi)Actin排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常改變，對照組和空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Actin排列正常，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變(見圖4)。

注：1為對照組,2為空轉(zhuǎn)染組，3為p25轉(zhuǎn)染組

圖3各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Cdk5、p25和p35的表達(dá)

Figure 3The expression of Cdk5,p25 and p35 among different transfected cells group

3　討論

Cdk5是細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶家族的特殊成員，是脯氨酸限制性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，Cdk5并不直接參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，主要通過對其底物的磷酸化來發(fā)揮功能。生理情況下，與p35結(jié)合而被激活，在維持神經(jīng)元和胰島細(xì)胞正常功能中發(fā)揮重要作用[3-4]。

在神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病的發(fā)生過程中，Cdk5通過如下機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，首先p35被水解形成分子量更小的多肽片段p25，并與Cdk5結(jié)合形成活性更高的Cdk5/p25復(fù)合物，使得Cdk5被過度激活，過度激活的Cdk5具有明顯的神經(jīng)毒性，通過誘導(dǎo)神經(jīng)元中tau的異常磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元骨架破壞，誘發(fā)神經(jīng)元的凋亡，使得機(jī)體相應(yīng)的功能發(fā)生障礙[5-6]。足細(xì)胞是腎小球基底膜外高度分化的細(xì)胞，參與腎小球的細(xì)胞濾過屏障。目前發(fā)現(xiàn)，Cdk5和p35也存在于腎小球足細(xì)胞，并具有維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的作用。本研究通過在足細(xì)胞中轉(zhuǎn)入p25基因觀察Cdk5/p25活性對足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。

Table 1The expression of apoptosis related protein Cleaved caspase3 and Cdk5 activition among different groups

組別光密度值Cdk5活性(×103CPM)對照組133±17 3.8±0.2空轉(zhuǎn)染組159±20 3.8±0.3p25轉(zhuǎn)染組409±17ab26.3±0.5abF值26.58025.320P值<0.001<0.001

注：Cdk5=周期素依賴性蛋白激酶5；與對照組比較，aP<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較，bP<0.05

圖4　各組Actin的排列和細(xì)胞形態(tài)(免疫熒光化學(xué)染色，×400)

前期研究發(fā)現(xiàn)，正常分化成熟的離體足細(xì)胞有Cdk5和p35的表達(dá)，Cdk5/p35活性在維持足細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮一定作用[7-8]，該結(jié)果在本研究中進(jìn)一步得到證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常腎組織和足細(xì)胞中沒有p25表達(dá)。將p25基因轉(zhuǎn)染足細(xì)胞時(shí)，Cdk5活性被過度活化，使細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3表達(dá)水平升高，足細(xì)胞內(nèi)Actin排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常改變，細(xì)胞凋亡增加，與神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞中誘發(fā)和轉(zhuǎn)入p25基因的研究結(jié)果相同[9-12]。說明p25過度激活Cdk5的活性引起細(xì)胞凋亡這一途徑在足細(xì)胞的凋亡中也同樣發(fā)生。

腎小球足細(xì)胞是一種終末分化的上皮細(xì)胞，生理情況下附著在腎小球基底膜外，是腎小球細(xì)胞最后一道屏障，損傷后無再生能力[13]，足細(xì)胞損傷常被認(rèn)為是導(dǎo)致各種腎小球疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素，足細(xì)胞的破壞已成為反映腎臟損傷嚴(yán)重程度和進(jìn)展的重要評判指標(biāo)。因此，p25可引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、誘發(fā)細(xì)胞凋亡，對研究引起腎小球足細(xì)胞損傷的原因、凋亡的機(jī)制以及足細(xì)胞損傷的治療具有重要意義。

綜上所述，生理情況下足細(xì)胞中沒有p25的表達(dá)，Cdk5被p35激活，在維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和生理功能中發(fā)揮重要作用。病理情況下，足細(xì)胞中表達(dá)p25也可引起Cdk5的過度激活，引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，形態(tài)改變，誘發(fā)足細(xì)胞凋亡。但誘發(fā)p25產(chǎn)生的病理情況以及Cdk5過度激活引起足細(xì)胞凋亡的機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

作者貢獻(xiàn)：陸曉華、鄭亞莉進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；張霞、李博、保莉、羅紅艷、曹麗、鄂靜、張彬、畢逢辰進(jìn)行課題實(shí)施、評估、資料收集；鄭亞莉進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Relationship Between Overactivation of Cdk5 and the Glomerulus Podocyte Apoptosis

LUXiao-hua,ZHENGYa-li,ZHANGXia,LIBo,BAOLi,LUOHong-yan,CAOLi,EJing,ZHANGBin,BIFeng-chen.

DepartmentofNephrology,NingxiaPeople′sHospital,Yinchuan750021,China

ZHENGYa-li,DepartmentofNephrology,NingxiaPeople′sHospital,Yinchuan750021,China；E-mail：424570556@qq.com

ObjectiveTo study the influence of Cdk5 activity on the structure and function of glomerulus podocyte by transfection of p25 gene.MethodsIn 2014，differentiated and mature isolated mouse podocytes were cultured in RPMI 1640 medium with 10% fetal bovine serum and divided into three groups including control group,empty group and p25 group.p25 gene was cloned through the pAdTrack-CMV viral vector,and transfected into podocytes.After 48 hours,cells were collected for further analysis.Cdk5,p25,p35,Cleaved caspase3 expressions were detected by Western blotting method;Cdk5 activity were tested through immunoprecipitation and isotope γ-32P marking methods.In order to observe the expression of Cdk5，p35 and structure of Actin in podocyte,immunofluorescent staining were conducted.ResultsCak5 in HEK293 cells had positive expression while p35 had negative expression;there were different levels of Cdk5 and p35 in renal cortex,podocyte and glomerulus.p25 had negative expression in control group and empty group while positive expression in p25 group.As for the expression levels of Cleaved caspase3 and Cdk5 activity in different groups,differences were of statistical significance(P<0.05);the expression levels of Cleaved caspase3 and Cdk5 activity in p25 group was higher than those in the other two groups(P<0.05).In p25 group,Actin within podocyte were arranged in disorder and forms of cells were abnormal,while those conditions were on the contrary in the other two groups.Conclusionp25 causes overactivation of Cdk5 and induces podocyte morphological change,Actin arrangement disorder and cell apoptosis.Therefore,Cdk5 activity plays an important role in maintaining normal structure and function of podocyte.

Podocytes；Cyclin-dependent kinase 5；p35；p25；Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160093，81460161)；寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ14160)；寧夏科技支撐基金資助項(xiàng)目(2013ZYS103)

750021寧夏銀川市，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(陸曉華，鄭亞莉，張霞，李博，保莉，羅紅艷，曹麗，鄂靜，畢逢辰)；寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(張彬)

鄭亞莉，750021寧夏銀川市，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail：424570556@qq.com

R 322.61

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.23.011

2015-11-24；

2016-04-25)