孔思遠(yuǎn)　吳　蓉　蔡雙璠　譚紅勝

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203; 2 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心，上海，201203)

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夏枯草抗皰疹病毒多糖的提取及純化工藝研究

孔思遠(yuǎn)1,2吳蓉1,2蔡雙璠1,2譚紅勝1,2

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203; 2 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心，上海，201203)

目的：優(yōu)化夏枯草抗皰疹病毒多糖的提取及純化工藝，為新藥研究提供科學(xué)依據(jù)。方法：以多糖含量和浸膏得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)法對夏枯草多糖提取過程中的提取次數(shù)，加水倍量及提取時間3個因素進(jìn)行優(yōu)化研究；以多糖含量及體外抗單純性皰疹病毒I型(HSV-1)活性為考察指標(biāo)，對超濾和醇沉兩種純化技術(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果：最優(yōu)水提工藝為第1次加水14倍，第2、3次加水12倍，提取3次，每次提取時間1.5 h；采用超濾和醇沉兩種技術(shù)分別純化所得多糖。通過MTT法測得醇沉多糖和超濾多糖抑制HSV-1的IC50分別為(93.99±13.12)μg/mL和(51.35±15.30)μg/mL，結(jié)果表明超濾技術(shù)制備的多糖提取物抗單純性皰疹病毒活性顯著高于醇沉技術(shù)。結(jié)論：采用超濾技術(shù)制備的夏枯草多糖具有較高的含量及抗單純性皰疹病毒活性，可作為夏枯草多糖開發(fā)新藥的純化工藝。

夏枯草；抗皰疹病毒；多糖；提??；純化；醇沉；超濾

夏枯草為唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，因“夏至后即枯”而得名。具有清肝泄火，明目，散結(jié)消腫等功效。用于治療目赤腫痛，目珠夜痛，頭痛眩暈，瘰疬，癭瘤，乳癰，乳癖，乳房脹痛等，民間飲用的歷史已有1000多年?，F(xiàn)代藥理及化學(xué)成分研究證明，夏枯草主要含有三萜、黃酮、苯丙素、甾體、有機(jī)酸、揮發(fā)油及多糖類等成分[1]，具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力等作用。從夏枯草中分離純化的多糖有抗Ⅰ型單純性皰疹病毒(HSV-1)和Ⅱ型單純性皰疹病毒(HSV-2)的作用，其作用機(jī)制不同于目前臨床藥物阿昔洛韋(ACV)，可能不是直接作用于病毒的復(fù)制環(huán)節(jié)，而是阻止病毒吸附和穿入宿主細(xì)胞，以及促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖和誘生干擾素等免疫調(diào)節(jié)作用，因此對標(biāo)準(zhǔn)病毒株和臨床耐藥株均有效，且不易產(chǎn)生耐藥性[2-6]。

本實(shí)驗(yàn)擬采用L9(34)正交試驗(yàn)對水提多糖過程中的提取次數(shù)、加水倍量和提取時間進(jìn)行優(yōu)選，以體外抗單純性皰疹病毒活性為評價指標(biāo)，對超濾純化多糖技術(shù)與傳統(tǒng)的醇沉純化多糖工藝進(jìn)行比較，為后續(xù)將夏枯草多糖開發(fā)為抗單純性皰疹病毒的新藥提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與材料

Spectrumlab 752S紫外-可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)，CPA2250電子分析天平(德國賽多利斯)，多功能酶標(biāo)儀(BioTeK Power Wave XS2)，冷凍干燥機(jī)(Alpha 2-4 LD plus CHRTST)，Pellicon XL FILTER Ultrafiltration Cassettes(Millipore Corporation)，Labscale TFF System(Millipore Corporation)。

D-葡萄糖、95%乙醇、蒽酮、硫酸、DMSO(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、HSV-1 KOS病毒(美國ATCC公司)，MTT、臺盼藍(lán)(上海生工生物有限公司)，PBS磷酸鹽緩沖鹽(福建邁新試劑生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、FBS(美國Invitrogen公司)，青霉素-鏈霉素(杭州吉諾生物有限公司)，ACV(中國藥品生物制品檢定所)。

夏枯草藥材購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室張紅梅副教授鑒定為唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗。

2　方法與結(jié)果

2.1夏枯草多糖的測定

2.1.1對照品溶液的配制精密稱取無水葡萄糖對照品50.00 mg，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度(制成每1 mL含無水葡萄糖0.2 mg的溶液)，即得。

2.1.20.1%硫酸-蒽酮試劑的配制精密稱取0.1 g蒽酮，加100 mL的80%硫酸溶液溶解，即得。

圖1　硫酸-蒽酮法測定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密量取對照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.9 mL，置具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入0.1%硫酸-蒽酮溶液5 mL，搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，參照紫外-可見分光光度法(2015年版《中華人民共和國藥典》通則0401)，在625 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得回歸方程為A=7.4443C+0.0302，r=0.9998。結(jié)果表明葡萄糖濃度在0.03～0.09 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4精密度試驗(yàn)精密量取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定吸光度值，重復(fù)測定6次，求得吸光度值的RSD值為0.00%。說明該儀器的精密度良好。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取夏枯草水提液樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下方法操作，每5 min測定1次吸光度，測定值在90 min內(nèi)保持穩(wěn)定，其RSD值為0.86%。表明處理后的提取液在90 min內(nèi)測定過程中狀態(tài)穩(wěn)定。

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)取夏枯草藥材粉約0.5 g，6份，精密稱定，按已確定的提取方法提取，測定，其RSD值為2.09%，多糖含量為10.56 mg/g。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.7加樣回收率試驗(yàn)稱已知含量的夏枯草藥材粗粉約0.25 g，共6份，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水50 mL，分別加入0.212 mg/mL的葡萄糖對照品水溶液0.8、1.0、1.2 mL各2份，加熱回流提取90 min，提取液過濾，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取5 mL，加入95%乙醇25 mL，搖勻，4 500 r/min離心10 min，傾去上清液，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，按擬定的含量測定方法測定，計算回收率。結(jié)果平均回收率為97.49%，其RSD值為2.17%。表明該測定方法準(zhǔn)確。

2.2浸膏得率的測定參照浸出物測定法(2015年版《中華人民共和國藥典》通則2201)，精密量取20 mL供試品溶液，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量。

表4　加樣回收率結(jié)果

2.3影響提取主要因素的優(yōu)化選擇提取次數(shù)、加水倍量、提取時間為考察因素，以夏枯草多糖含量(夏枯草多糖含量=多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量)和浸膏得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計優(yōu)選最佳水提工藝條件，因素與水平見表5。

表5　因素與水平

表6　正交試驗(yàn)的設(shè)計和結(jié)果

表7　多糖含量方差分析

稱取夏枯草藥材50 g，9份，按正交設(shè)計方案安排加熱回流提取，濾過，合并水提液，加水定容至1 750 mL，搖勻，精密量取2 mL置15 mL離心管中，加入15 mL 95%的乙醇溶液，4 ℃下靜置1 h，離心(4 000 r/min、10 min)，傾去上清液，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取供試品溶液2 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法測定，計算夏枯草中多糖含量和浸膏得率。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表6～表9。

表8　正交試驗(yàn)的設(shè)計和結(jié)果

由分析結(jié)果可知，提取次數(shù)對多糖含量和浸膏得率均有顯著性影響，提取時間對多糖含量有顯著性影響而對浸膏得率無顯著性影響，料液比對多糖含量和浸膏得率均無顯著性影響，綜合多糖含量和浸膏得率兩個指標(biāo)，從節(jié)約時間，降低能耗的生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，在保證提取充分的前提下，綜合分析各個影響因素，擬定最佳工藝條件為A3B1C3，由于藥材的吸水量為藥材重量的2倍，考慮提取時料液能將藥材浸沒，選擇料液比為12，因此最佳工藝為第1次加水14倍，第2、3次加水12倍，提取3次，提取時間1.5 h。

表9　浸膏得率方差分析

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)對所選最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，按優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表10，該水提工藝條件穩(wěn)定性良好。

表10　水提多糖驗(yàn)證結(jié)果

2.5純化工藝醇沉工藝：預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50%乙醇濃度制備的夏枯草粗多糖純度(夏枯草多糖純度=多糖質(zhì)量/浸膏質(zhì)量)最高，抗單純性皰疹病毒活性最好。因此，選擇醇沉終濃度為50%。取夏枯草提取液濃縮至適當(dāng)密度，加入乙醇使醇沉體積分?jǐn)?shù)達(dá)50%，靜置12 h，離心，收取沉淀，揮去乙醇，凍干，備用。

超濾工藝：預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同截留分子量制備的夏枯草粗多糖純度無顯著差異，而截留分子量50KDa所得的樣品抗單純性皰疹病毒活性最好。因此，選擇截留分子量50KDa的濾膜。取夏枯草水提液原液200 mL過0.45 μm水相膜，濾液至于Labscale TFF System樣品杯中連接50KDa Pellicon3? XL超濾膜包，將上下兩壓力表的壓力差保持在10psi，并調(diào)節(jié)回流速度，當(dāng)樣品杯中剩余10 mL溶液時收集樣品，凍干，備用。

對醇沉和超濾兩種純化工藝制備的樣品進(jìn)行夏枯草粗多糖的純度測定(硫酸-蒽酮法測定含量，計算純度)，結(jié)果見表11。

表11　粗多糖純度n=6

表12　樣本t檢驗(yàn)

由表11和表12結(jié)果可見，超濾技術(shù)制備的粗多糖純度高于傳統(tǒng)的醇沉工藝，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)將Vero細(xì)胞計數(shù)后，以2×104/孔接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)長滿單層后，棄去培養(yǎng)液，再加入含不同濃度夏枯草多糖的培養(yǎng)基(200、100、50、25 μg/mL)，每濃度3個復(fù)孔，每孔200 μL，同時設(shè)正常細(xì)胞對照組和陽性藥物對照組(ACV)。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，吸去培養(yǎng)液，加入MTT，培養(yǎng)4 h，加入DMSO，在570/650 nm波長下測定吸光度，計算CC50值。存活率=(藥物組-病毒感染組)/(細(xì)胞組-病毒感染組)×100%。抑制率=(細(xì)胞組-藥物組)/(細(xì)胞組-調(diào)零組)×100%。

由表13結(jié)果可見，夏枯草醇沉多糖和超濾多糖在1 600 g/mL濃度以下均無毒性。

表13　樣本的CC50和抗HSV-1的IC50(MTT法)

表14　樣本t檢驗(yàn)

2.7體外抗皰疹病毒活性測定實(shí)驗(yàn)方法(MTT法)將Vero細(xì)胞計數(shù)后，以2×104/孔接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)長滿單層后，吸棄培養(yǎng)液，每孔接種病毒液100 TCID 50/孔，于37 ℃吸附1 h，吸棄病毒液，再加入不同濃度的夏枯草多糖溶液(200、100、50、25、12.5 μg/mL)，每濃度3個復(fù)孔，每孔200 μL，同時設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組、陽性藥物對照組(ACV：4、2、1、0.5、0.25 μM)。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，每天觀察CPE，并記錄；顯微鏡下觀察細(xì)胞病變程度(CPE)，以確定藥物對病毒的抑制作用，記錄方式：0%細(xì)胞病變?yōu)椤?”，<25%細(xì)胞病變?yōu)椤?”，25%～50%細(xì)胞病變?yōu)椤?+”，50%～75%細(xì)胞病變?yōu)椤?++”，>75%細(xì)胞病變?yōu)椤?+++”，以出現(xiàn)“-”的最小濃度為抗病毒活性最佳。培養(yǎng)72 h后，吸去培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液，再加入MTT，培養(yǎng)4 h，加入DMSO，在570/650 nm波長下測定吸光度，計算IC50值。存活率=(藥物組-病毒感染組)/(細(xì)胞組-病毒感染組)×100%，通過Spss軟件計算夏枯草多糖提取物對HSV-1和HSV-2抑制作用的IC50。SI=CC50/IC50，治療指數(shù)(SI)越大，抗病毒活性越好。

由表13和表14結(jié)果表明，通過MTT法篩選，醇沉工藝和超濾工藝都具有抗皰疹I(lǐng)型病毒活性呈差異(P<0.05)，且超濾技術(shù)制備的樣品抗單純性皰疹病毒活性優(yōu)于醇沉工藝。

圖2　50%醇沉和50KDa超濾多糖提取物CPE圖(HSV-1)

由圖2結(jié)果表明，50%醇沉和50KDa超濾多糖提取物隨著濃度增加，抑制病毒活性也增加，通過MTT/CPE法實(shí)驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)超濾工藝提取物的抑制皰疹病毒作用優(yōu)于醇沉工藝提取物。

3　討論

多糖的含量測定方法常采用比色法，分別為蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法和咔唑-硫酸法。蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法是用于測定多糖含量最為廣泛的分析方法，其原理為糖類物質(zhì)在強(qiáng)酸性條件下水解成單糖分子，并迅速脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合形成有特殊顏色的物質(zhì)，該物質(zhì)在紫外區(qū)有特征吸收，且吸收值在一定范圍內(nèi)與糖質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。在選擇測定方法時，考慮到蒽酮-硫酸法能測定溶液中全部可溶性碳水化合物的總量，并且蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均優(yōu)于苯酚-硫酸法，所以本實(shí)驗(yàn)選擇蒽酮-硫酸法測定夏枯草多糖[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計優(yōu)選夏枯草的水提取工

藝，以夏枯草多糖含量和浸膏得率為考察指標(biāo)，采用綜合評分的方法確定最佳提取工藝為：藥材第一次加14倍量水，第二、三次加12倍量水，提取3次，每次回流1.5 h。按最佳工藝進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明穩(wěn)定性較理想，該方案節(jié)約能耗，成本低，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，故此方案合理可行。

本實(shí)驗(yàn)比較了膜分離超濾技術(shù)與傳統(tǒng)醇沉工藝對夏枯草活性部位的制備，結(jié)果顯示，用超濾技術(shù)制備的夏枯草樣品，多糖純度和抗單純性皰疹病毒活性均優(yōu)于傳統(tǒng)的醇沉工藝。二者的純化原理不同，超濾是一種膜分離技術(shù)，其工作原理是以選擇性透過膜為分離遞質(zhì)，在外界壓力作用下，原料組分選擇性地透過膜，以達(dá)到分離、提純的目的，自20世紀(jì)80年代初起被應(yīng)用于中藥的純化工藝中。醇沉工藝是根據(jù)相似相溶的原理，使不溶于乙醇的成分溶解度下降沉淀的過程。超濾作為新興的高效膜分離技術(shù)，具有分離精度高、成本低、環(huán)保、操作簡單等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的水提醇沉純化多糖相比較，超濾法顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢，正被越來越多的中藥研究者加以應(yīng)用，提示可作為夏枯草開發(fā)成抗單純性皰疹病毒新藥有效部位的純化工藝。

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(2016-07-05收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Extraction and Purification of Anti-HSV Polysaccharides from Prunella Vulgaris

Kong Siyuan1,2，Wu Rong1,2，Cai Shuangfan1,2，Tan Hongsheng1,2

(1SchoolofPharmacy，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China；2EngineeringResearchCenterofShanghaiCollegesforTCMNewDrugDiscovery，Shanghai201203，China)

Objective:The aim of this study is to optimize the extraction and purification process for anti-HSV polysaccharides from Prunella Vulgaris.Methods:The extraction method was modified by an orthogonal array experiment on three variable parameters：extraction time，solvent volume and extraction times.The content of polysaccharides and extraction yield were used as index.The effects of ultrafiltration technology and alcohol precipitation were compared in the purity of polysaccharide and anti-HSV activity.Results:The optimized extraction parameters are three extractions，1.5 hour extraction time，14 times of water for the first extraction and 12 times of water for the second and third extraction.The polysaccharide obtained from ultrafiltration technology and alcohol precipitation showed anti-HSV-1 activity in MTT assay，with IC50values of(93.99 ± 13.12)μg/mL and(51.35 ± 15.30)μg/mL，respectively.The results suggested that the two purification processes have significantly different degrees of polysaccharide purity.The anti-HSV activity of polysaccharide from ultrafiltration technology was significantly higher than that of alcohol precipitation.Conclusion:The polysaccharides from Prunella Vulgaris obtained using ultrafiltration technology have higher anti-HSV activity than that isolated by alcohol precipitation.

Prunella Vulgaris L.; Anti-HSV; Polysaccharides; Extraction; Purification; Alcohol precipitation; Ultrafiltration

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“十二五”計劃(編號：2013ZX09103002-020)

孔思遠(yuǎn)(1991.02—)，男，碩士研究生，研究方向：中藥活性成分研究，E-mail：602552484@qq.com

譚紅勝(1977.05—)，女，博士，副研究員，研究方向：中藥活性成分研究及中藥新藥研發(fā)，E-mail：ths97029@163.com

R285.0

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.002