席志超　姚　睦　李　洋　蔡雙璠　吳　蓉　勞遠(yuǎn)至　董其瀚，4　徐宏喜

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海，201203； 2 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心，上海，201203；3 悉尼大學(xué)，悉尼，2006； 4 西悉尼大學(xué)，悉尼，2753)

?

Guttiferone K抑制靜止期前列腺癌細(xì)胞重新激活的作用研究

席志超1,2姚睦3李洋1,2蔡雙璠1,2吳蓉1,2勞遠(yuǎn)至1,2董其瀚3，4徐宏喜1,2

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海，201203； 2 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心，上海，201203；3 悉尼大學(xué)，悉尼，2006； 4 西悉尼大學(xué)，悉尼，2753)

目的：觀察從云南藤黃(Garciniayunnanensis)中提取分離得到的PPAPs(Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinol)類化合物Guttiferone K(GUTK)對(duì)人靜止期前列腺癌LNCaP細(xì)胞重新激活的影響。方法：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人前列腺癌LNCaP細(xì)胞去除血清培養(yǎng)7d誘導(dǎo)其進(jìn)入靜止期,通過再次加入血清培養(yǎng)使其重新激活進(jìn)入細(xì)胞周期，同時(shí)給予GUTK進(jìn)行干預(yù)。用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)Ki-67蛋白表達(dá)的變化；利用PI染色的流式分析法和EdU Incorporation法檢測(cè)GUTK對(duì)細(xì)胞周期分布的影響；利用Western Blotting法檢測(cè)Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果：GUTK呈劑量依賴性地抑制靜止期LNCaP細(xì)胞的再次增殖并阻止靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入S期；GUTK在靜止期LNCaP細(xì)胞激活的早期明顯下調(diào)了Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：從云南藤黃中提取分離得到的化合物GUTK能夠抑制人靜止期前列腺癌LNCaP細(xì)胞的重新激活，具有潛在的延緩前列腺癌病情發(fā)展和預(yù)防復(fù)發(fā)的作用。

云南藤黃；Guttiferone K；靜止期癌細(xì)胞；前列腺癌

ofSydney，Sydney2006，Australia; 4TheUniversityofWesternSydney，Sydney2753，Australia)

前列腺癌已成為發(fā)病率最高的男性癌癥[1-2]，嚴(yán)重威脅著男性的身體健康。前列腺癌在癥狀表現(xiàn)上差異很大，有些患者甚至沒有明顯的癥狀。因其發(fā)病的隱匿性，早期的前列腺癌篩查主要是通過檢測(cè)血清前列腺特異抗原值(Prostate-Specific Antigen,PSA)。但PSA水平的波動(dòng)不僅僅與前列腺癌有關(guān)，良性前列腺增生、前列腺炎也會(huì)影響其水平。這種非特異性的前列腺癌生物標(biāo)記就導(dǎo)致了前列腺癌的假陽(yáng)性診斷率大幅升高，進(jìn)而在一定程度上導(dǎo)致了前列腺癌的發(fā)病率高于死亡率6倍[1]。所以，經(jīng)過篩查發(fā)現(xiàn)的早期低風(fēng)險(xiǎn)前列腺癌患者，一般不會(huì)立即采取放化療等具有一定傷害性的治療手段，而是采用動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的方法來觀察疾病的發(fā)展。然而相關(guān)研究表明，在進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的患者中，依然有35%的患者會(huì)在47個(gè)月左右出現(xiàn)癌癥惡化的現(xiàn)象[3]，而目前臨床上幾乎沒有可以延緩癌癥發(fā)展進(jìn)程的治療手段。

在成年人的正常組織中，絕大部分細(xì)胞都處于靜止期(G0期)[4]。同樣，在多種腫瘤中也已經(jīng)證實(shí)了靜止期腫瘤細(xì)胞的存在[5-6]。在促有絲分裂的信號(hào)刺激下，靜止期細(xì)胞重新進(jìn)入G1期并啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程，這個(gè)過程被稱為靜止期細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。在前列腺癌發(fā)展的過程中，核增殖蛋白Ki-67呈陰性的腫瘤細(xì)胞會(huì)隨著癌癥的惡化而逐漸減少[7]，這意味著靜止期腫瘤細(xì)胞被激活轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋称诘哪[瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤的臨床預(yù)后將產(chǎn)生不良影響。

研究表明，靜止期腫瘤細(xì)胞的再次增殖是導(dǎo)致癌癥病程進(jìn)展及癌癥復(fù)發(fā)的重要原因之一。所以，發(fā)現(xiàn)和研究針對(duì)抑制靜止期前列腺癌細(xì)胞激活的藥物，將為延緩前列腺癌的病情發(fā)展和預(yù)防復(fù)發(fā)提供新的治療策略。天然產(chǎn)物是活性化合物和新藥研發(fā)的重要來源，藤黃屬(GarciniaL.)植物多為喬木或灌木，在我國(guó)共有22種，分布于云南、廣東、廣西、海南、臺(tái)灣和西藏及沿海部分地區(qū)。近年來，本課題組對(duì)多種藤黃屬植物進(jìn)行了系統(tǒng)的抗腫瘤活性成分研究，建立了藤黃屬植物來源的化合物庫(kù)，并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有顯著抗腫瘤活性的化合物[8-14]。在前期的篩選中，我們以藤黃屬化合物庫(kù)中的小分子化合物，針對(duì)靜止期前列腺癌LNCaP細(xì)胞進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)GUTK對(duì)靜止期前列腺癌LNCaP細(xì)胞的重新激活具有明顯的抑制作用。本研究將進(jìn)一步探索GUTK對(duì)靜止期前列腺癌LNCaP細(xì)胞重新激活的影響并初步探究其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株人前列腺癌LNCaP細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥品與試劑Guttiferone K(GUTK)為本課題組從云南藤黃中提取分離得到的化合物，其純度為98%；碘化丙啶(PI)，二甲基亞砜(DMSO)和RNase A購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；石蠟液和瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Click-ItTMEdU Flow Cytometry Assay Kit(C35002)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；蘇木素染料，甘油明膠封片液，免疫染色封閉液和DAB顯色液購(gòu)自江蘇碧云天生物公司；Ki-67(ab92353)，Cyclin D1(ab40754)，Cyclin D3(ab52598)，Cdk4(ab108357)，Cdk6(ab124821)和E2F1(ab137415)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑三聯(lián)試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒和ECL發(fā)光液購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。

1.2儀器全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Themo公司)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

1.3方法

1.3.1靜止期LNCaP細(xì)胞的培養(yǎng)方法采用去血清培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞的方法，在體外建立穩(wěn)定的靜止期前列腺癌細(xì)胞模型。具體操作如下：當(dāng)用含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)的LNCaP細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，將培養(yǎng)基換成無FBS的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)7d，得到靜止期的LNCaP細(xì)胞。通過再次加入含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)使其重新激活進(jìn)入細(xì)胞周期，同時(shí)給予GUTK進(jìn)行干預(yù)。

1.3.2免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ki-67蛋白的表達(dá)水平在LNCaP細(xì)胞從靜止期釋放的同時(shí)，分別給予5 μM/10 μM GUTK和DMSO處理細(xì)胞72 h。用1 mL 10%中性福爾馬林吹打細(xì)胞，置于4 ℃過夜固定；離心，棄上清液，用1%瓊脂糖包裹細(xì)胞沉淀，進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋并切片(厚度為5 μm)。表面抗原修復(fù)后孵育一抗Ki-67(1∶500)并在4 ℃過夜；室溫放置10 min，孵育二抗30 min后，與HRP生物標(biāo)志鏈反應(yīng)；蘇木素染色5～20 min，蒸餾水沖洗2 min，鹽酸乙醇分化15 s后蒸餾水沖洗泛藍(lán)5 min；脫水后以中性樹脂封片，晾干，置于顯微鏡下拍照觀察。

1.3.3應(yīng)用PI染色的流式分析法檢測(cè)GUTK對(duì)細(xì)胞周期分布的影響將靜止期人前列腺癌細(xì)胞LNCaP(2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔)接種于6孔板中使其重新進(jìn)入細(xì)胞周期，同時(shí)分別給予5 μM/10 μM GUTK和DMSO處理細(xì)胞72 h；收集細(xì)胞到15 mL的管中，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液；用300 μL的PBS重懸細(xì)胞，逐滴加入700 μL預(yù)冷的無水乙醇，且邊加邊渦旋，4 ℃固定過夜；離心棄上清，并用PBS洗滌細(xì)胞；用含有100 μg/mL RNase A和20 μg/mL PI的PBS 500 μL重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育60 min；離心，棄上清，用500 μL PBS重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，并用FlowJo軟件(8.1.1版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4應(yīng)用EdU Incorporation法檢測(cè)GUTK對(duì)靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入S期的影響將靜止期人前列腺癌細(xì)胞LNCaP(2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔)接種于6孔板中使其重新進(jìn)入細(xì)胞周期，同時(shí)分別給予5 μM/10 μM GUTK和DMSO處理細(xì)胞72 h；在收集細(xì)胞前8 h加入10 μM 5-ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU)進(jìn)行孵育，收集細(xì)胞后按照試劑盒的要求進(jìn)行染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并用FlowJo軟件(8.1.1版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5Western Blotting檢測(cè)Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白的表達(dá)水平在LNCaP細(xì)胞從靜止期釋放的同時(shí)，分別給予5 μM/10 μM GUTK和DMSO處理細(xì)胞1～48 h。同時(shí)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP細(xì)胞作為增殖期的細(xì)胞對(duì)照；收集細(xì)胞到1.5 mL的管中，離心，棄上清液；將RIPA細(xì)胞裂解液和去磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF按照100∶1∶1∶1混合均勻；加入不同的細(xì)胞樣品中，反復(fù)吹打并渦旋，置冰上裂解20 min；離心20 min，棄沉淀；采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20 μg蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合，置于99 ℃金屬浴煮蛋白8 min；對(duì)樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜和封閉并孵育一抗，4 ℃搖床上孵育過夜；TBST洗膜3次，每次15 min，室溫?fù)u床上孵育二抗60 min；TBST洗膜3次，每次15 min；將ECL的A液和B液混合，滴加在膜上，放入成像儀進(jìn)行曝光。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2013軟件及SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以Students′ t-test方法進(jìn)行2組間的比較，用one-way ANOVA進(jìn)行多組間的方差分析，P<0.05或P<0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1GUTK抑制靜止期LNCaP細(xì)胞的再次增殖Ki-67為核增殖標(biāo)志蛋白，細(xì)胞處于增殖期(G0/1、S和G2/M期)時(shí)其表達(dá)呈陽(yáng)性，處于靜止期(G0期)時(shí)呈陰性。結(jié)果如圖1所示，在去血清培養(yǎng)7d的靜止期LNCaP細(xì)胞中，Ki-67蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性的細(xì)胞很少(圖1A)。當(dāng)靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的過程中，以5 μM/10 μM的GUTK或DMSO分別作用72 h后，可見DMSO組的大部分細(xì)胞都已經(jīng)重新處于增殖期，Ki-67蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多(圖1B)。而GUTK可以呈劑量依賴性的減少Ki-67蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性的細(xì)胞，說明GUTK可以抑制靜止期LNCaP細(xì)胞重新增殖(圖1C，圖1D)。

2.2GUTK阻礙靜止期LNCaP細(xì)胞重新啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程2.1的結(jié)果證明GUTK抑制靜止期LNCaP細(xì)胞的再次增殖，表明GUTK有可能影響了靜止期前列腺癌LNCaP細(xì)胞重新啟動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。我們通過PI染色的流式分析法檢測(cè)GUTK在靜止期LNCaP細(xì)胞激活的過程中對(duì)周期分布的影響。結(jié)果如表1所示，在去血清培養(yǎng)7 d的靜止期LNCaP細(xì)胞中，G0/1、S和G2/M期的細(xì)胞比例分別為90.7%、2.2%和5.1%。在靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的過程中，以5 μM/10 μM的GUTK或DMSO分別作用72 h后，可見DMSO組的G0/1期細(xì)胞減少至69.0%，S和G2/M期的細(xì)胞比例增加至13.4%和17.3%，與靜止期LNCaP細(xì)胞的周期分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)，說明G0/1期細(xì)胞已經(jīng)重新進(jìn)入細(xì)胞周期。而5 μM和10 μM GUTK組的G0/1期細(xì)胞明顯高于DMSO組，分別為81.5%和84.4%(△P<0.05)，S和G2/M期的細(xì)胞比例也較DMSO組有明顯的降低(△P<0.05)。以上結(jié)果說明，GUTK可以呈劑量依賴性地阻止G0/1期細(xì)胞的減少，以及S和G2/M期細(xì)胞的增多，說明GUTK可以阻礙靜止期LNCaP細(xì)胞重新啟動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。

圖1　免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ki-67蛋白的表達(dá)水平

注：標(biāo)尺=100 μm。

表1　PI染色的流式分析法檢測(cè)細(xì)胞周期分布

注：3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，與靜止期LNCaP細(xì)胞組比較*P<0.05；與DMSO組比較△P<0.05。

2.3GUTK阻礙靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入S期EdU可以在DNA合成時(shí)插入染色體，并通過熒光檢測(cè)進(jìn)行定量分析。為了進(jìn)一步探索GUTK是如何阻礙靜止期LNCaP細(xì)胞重新啟動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程，我們采用EdU Incorporation的方法檢測(cè)GUTK是否可以阻礙靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入S期。結(jié)果如圖2所示，在去血清培養(yǎng)7 d的靜止期LNCaP細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞比例很低。當(dāng)靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的過程中，以5 μM/10 μM的GUTK或DMSO分別作用72 h后，可見DMSO組的S期細(xì)胞有了明顯增加，與靜止期LNCaP細(xì)胞組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)，說明細(xì)胞重新進(jìn)入S期。而GUTK可以呈劑量依賴性地抑制S期細(xì)胞的增多，與DMSO組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(△P<0.05)，且GUTK高劑量組的作用明顯優(yōu)于低劑量組(△P<0.05)，說明GUTK可以阻礙靜止期LNCaP細(xì)胞重新進(jìn)入S期，并且具有較好的劑量依賴性。

圖2　EdU Incorporation法檢測(cè)處于S期的細(xì)胞比例

注：3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，與靜止期LNCaP細(xì)胞組比較*P<0.05；與DMSO組比較△P<0.05；與GUTK 5 μM組比較△P<0.05。

2.4GUTK在靜止期LNCaP細(xì)胞激活的早期下調(diào)Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白的表達(dá)水平Cyclin(周期蛋白)/CDK(cyclin-dependent kinases，周期蛋白依賴性蛋白激酶)-E2F1通路在靜止期細(xì)胞重新激活的過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[4]。為了進(jìn)一步探討GUTK抑制靜止期前列腺癌LNCaP細(xì)胞激活的作用機(jī)制，我們對(duì)這一通路的主要蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，增殖期LNCaP細(xì)胞(Cont)中Cyclin D1/3，Cyclin E1和CDK4/6/2的表達(dá)水平均高于靜止期LNCaP細(xì)胞(Qsct)。在細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的過程中，這些蛋白的表達(dá)量分別在6 h到12 h開始增加，Cyclin-CDK復(fù)合物被激活，增加了E2F1蛋白的表達(dá)，促使靜止期細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。而以5 μM/10 μM GUTK處理的LNCaP細(xì)胞，有效抑制了Cyclin D1/3，Cyclin E1和CDK4/2蛋白表達(dá)的增加，從而抑制了E2F1的增加。但對(duì)CDK6的作用不明顯。以上結(jié)果可以表明，GUTK在靜止期LNCaP細(xì)胞重新啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程的早期，通過調(diào)控Cyclin/CDK-E2F1通路的主要蛋白，從而抑制靜止期人前列腺癌細(xì)胞LNCaP重新激活。

圖3　Western Blotting檢測(cè)Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白的表達(dá)水平

注：α-Tubulin為上樣內(nèi)參，Cont為增殖期的LNCaP細(xì)胞，Qsct代表靜止期的LNCaP細(xì)胞。

3　討論

靜止期(G0/1)細(xì)胞可以重新啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程，分裂出新的子代細(xì)胞用以替代受損的細(xì)胞或已經(jīng)發(fā)生功能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞[15]。類似地，靜止期腫瘤細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期也是癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)自我更新的重要機(jī)制，這就導(dǎo)致了癌癥病程的進(jìn)展以及癌癥的復(fù)發(fā)，此外還可以降低癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。但是，目前臨床上還沒有針對(duì)于靜止期腫瘤細(xì)胞的治療藥物。為了發(fā)現(xiàn)和研究針對(duì)抑制靜止期前列腺癌細(xì)胞激活的藥物，我們建立了體外靜止期前列腺癌細(xì)胞模型，并對(duì)藤黃屬化合物進(jìn)行了活性篩選，希望可以發(fā)現(xiàn)活性化合物，為延緩前列腺癌的病情發(fā)展和預(yù)防復(fù)發(fā)提供新的治療策略。

在靜止期細(xì)胞重新激活回到細(xì)胞周期的過程中，有很多蛋白參與調(diào)控了細(xì)胞周期的進(jìn)程。促有絲分裂信號(hào)會(huì)激活Cyclin/CDK復(fù)合物，Cyclin/CDK復(fù)合物將調(diào)控細(xì)胞依次通過G0/1、S、G2和M期，完成整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程。Cyclin只有和CDKs形成復(fù)合物時(shí)才具有活性。形成的Cyclin-CDK復(fù)合物通過激活或抑制目的蛋白的活性，從而推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程有序進(jìn)行。此外，Cyclin-CDK復(fù)合物還可通過泛素化降解可以抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白活性。G0期的細(xì)胞在促有絲分裂信號(hào)的刺激下，Cyclin-CDK復(fù)合物被激活并磷酸化視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白R(shí)b，導(dǎo)致真核生物轉(zhuǎn)錄因子2(E2F)的釋放[16]。E2F會(huì)進(jìn)一步激活其下游的靶基因[17]，包括促進(jìn)DNA復(fù)制的基因，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期并啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。GUTK可以在靜止期LNCaP細(xì)胞激活的早期就明顯下調(diào)Cyclin D1/3、CDK4/6和E2F1蛋白的表達(dá)水平，從而抑制靜止期LNCaP細(xì)胞激活。但是，GUTK是如何調(diào)控這一通路的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究。

[1]R.L.Siegel，K.D.Miller，A.Jemal.Cancer statistics，2015[J].CA Cancer J Clin，2015，65(1)：5-29.

[2]韓蘇軍，張思維，陳萬青,等.中國(guó)前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2013,18(4)：330-334.

[3]M.R.Cooperberg，J.E.Cowan，J.F.Hilton，et al.Outcomes of active surveillance for men with intermediate-risk prostate cancer[J].J Clin Oncol，2011，29(2)：228-234.

[4]M.Malumbres，M.Barbacid.To cycle or not to cycle：a critical decision in cancer[J].Nat Rev Cancer，2001，1(3)：222-231.

[5]R.C.Jackson.The problem of the quiescent cancer cell[J].Adv Enzyme Regul，1989，29：27-46.

[6]L.Sang，J.M.Roberts，H.A.Coller.Hijacking HES1：how tumors co-opt the anti-differentiation strategies of quiescent cells[J].Trends Mol Med，2010，16(1)：17-26.

[7]R.R.Berges，J.Vukanovic，J.I.Epstein，et al.Implication of Cell Kinetic Changes During the Progression of Human Prostatic Cancer[J].Clin Cancer Res，1995，1(5)：473-480.

[8]X.Wang，Y.Lao，N.Xu，et al.Oblongifolin C inhibits metastasis by up-regulating keratin 18 and tubulins[J].Sci Rep，2015，5：10293.

[9]W.Xu，M.Cheng，Y.Lao，et al.DNA damage and ER stress contribute to oblongifolin C-induced cell killing in Bax/Bak-deficient cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，457(3)：300-306.

[10]Y.Lao，G.Wan，Z.Liu，et al.The natural compound oblongifolin C inhibits autophagic flux and enhances antitumor efficacy of nutrient deprivation[J].Autophagy，2014，10(5)：736-749.

[11]L.Xu，Y.Lao，Y.Zhao，et al.Screening Active Compounds from Garcinia Species Native to China Reveals Novel Compounds Targeting the STAT/JAK Signaling Pathway[J].Biomed Res Int，2015：910453.

[12]M.Wu，Y.Lao，N.Xu，et al.Guttiferone K induces autophagy and sensitizes cancer cells to nutrient stress-induced cell death[J].Phytomedicine，2015，22(10)：902-910.

[13]X.Li，Y.Lao，H.Zhang，et al.The natural compound Guttiferone F sensitizes prostate cancer to starvation induced apoptosis via calcium and JNK elevation[J].BMC Cancer，2015，15：254.

[14]K.Shen，J.Xie，H.Wang，et al.Cambogin Induces Caspase-Independent Apoptosis through the ROS/JNK Pathway and Epigenetic Regulation in Breast Cancer Cells[J].Mol Cancer Ther，2015，14(7)：1738-1749.

[15]J.H.Meserve，R.J.Duronio.Scalloped and Yorkie are required for cell cycle re-entry of quiescent cells after tissue damage[J].Development，2015，142(16)：2740-2751.

[16]L.Zhan，Y.Zhang，W.Wang，et al.E2F1：a promising regulator in ovarian carcinoma[J].Tumour Biol，2016，37(3)：2823-31.

[17]L.Magri，V.A.Swiss，B.Jablonska，et al.E2F1 coregulates cell cycle genes and chromatin components during the transition of oligodendrocyte progenitors from proliferation to differentiation[J].J Neurosci，2014，34(4)：1481-1493.

(2016-07-05收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effect of Guttiferone K on Inhibiting Reactivation of Quiescent Prostate Cancer Cells

Xi Zhichao1,2，Yao Mu3，Li Yang1,2，Cai Shuangfan1,2，Wu Rong1,2，Lao Yuanzhi1,2，Dong Qihan3,4，Xu Hongxi1,2

(1SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China; 2EngineeringResearchCenterofShanghaiCollegesforTCMNewDrugDiscovery，Shanghai201203，China; 3TheUniversity

Objective:To investigate the effect of Guttiferone K(GUTK)，a polycyclic polyprenylated acylphloroglucinol(PPAPs)compound isolated from Garcinia yunnanensis，on inhibiting reactivation of quiescent prostate cancer LNCaP cells.Methods：LNCaP cells were induced into a quiescent stage by seven days of serum withdrawal and stimulated cell cycle re-entry with or without GUTK by serum restoration.Ki-67 protein expression level was detected by Immunocytochemistry.Flow cytometry of Propidium iodide(PI)staining and EdU Incorporation assay were used to analyze cell cycle phase distribution.Protein levels of Cyclin D1/3、CDK4/6 and E2F1 were detected by Western blotting.Results：GUTK dose-dependently blocked the re-proliferation and S phase re-entry of quiescent LNCaP cells.GUTK decreased the Cyclin D1/3、CDK4/6 and E2F1 protein levels during quiescent LNCaP cell cycle re-entry.Conclusion：GUTK，a compound isolated from Garcinia yunnanensis，has the potential to inhibit cancer progression and prevent cancer recurrence by suppressing cell cycle re-entry of quiescent prostate cancer LNCaP cells.

Garcinia yunnanensis; Guttiferone K; Quiescent cancer cell; Prostate cancer

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：81130069)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：81173485)

席志超(1987.11—)，女，博士研究生，研究方向：中藥抗腫瘤機(jī)制研究，E-mail：xizhichaohaerbin@163.com

徐宏喜(1961.07—)，男，博士，教授，院長(zhǎng)，研究方向：中藥活性成分及藥理作用機(jī)制研究，E-mail：xuhongxi88@gmail.com

R285

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.005