徐雨，馮明祥，韋登雄，陳穎，劉蘋，楊和俊，陳永翠

(貴州省關(guān)嶺縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 關(guān)嶺 561300)

一株雞多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

徐雨，馮明祥，韋登雄，陳穎，劉蘋，楊和俊，陳永翠

(貴州省關(guān)嶺縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 關(guān)嶺 561300)

為確診貴州省安順市某土雞養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)的疫病，無菌挑取病雞的心、肝、脾和全血分別接種至血瓊脂平板、TSA平板和麥康凱瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，分離菌經(jīng)革蘭氏染色、生化實(shí)驗(yàn)，PCR鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:分離菌為多殺性巴氏桿菌，該菌對(duì)慶大霉素、米諾環(huán)素中度敏感，對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星等其他藥物不敏感。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)成功分離鑒定了一株雞多殺性巴氏桿菌。根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)該場(chǎng)用藥后，疫情得到控制。

多殺性巴氏桿菌;分離;鑒定;藥敏實(shí)驗(yàn)

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起禽的接觸性烈性傳染?。?］，臨床癥狀主要有病雞精神沉郁，排出綠色或白色稀糞，呼吸困難等，發(fā)病急，發(fā)病率、死亡率高，廣泛分布于世界各地［2］。本文對(duì)安順市某土雞養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)疫病的病雞進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、PCR鑒定、動(dòng)物性致病實(shí)驗(yàn)等，以期確定病原，同時(shí)通過藥敏實(shí)驗(yàn)為該場(chǎng)用藥進(jìn)行指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及發(fā)病情況:2015年5月，安順市某土雞養(yǎng)殖場(chǎng)8 000只180日齡土雞發(fā)病，少部分病雞流涎，排綠色稀糞，無其他明顯癥狀。有的正常吃食，站立時(shí)突然死亡。病雞發(fā)病7天，共死亡1 800只，死亡率22.5%，飼料拌喂環(huán)丙沙星、硫酸粘菌素、恩諾沙星、硫酸新霉素和青霉素等藥物，未能控制病情。

1.1.2 試劑:血瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、PCR MIX、DNA marker(Biomiga)、藥敏紙片、生化試管，均購于杭州微生物試劑有限公司(批號(hào):20150907)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離:無菌采集病雞心、肝、脾和全血分別接種血瓊脂平板、TSA和麥康凱平板，37℃培養(yǎng)24 h觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取單個(gè)菌落劃線接種TSA平板，37℃培養(yǎng)24 h后，對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 生化試驗(yàn):對(duì)分離菌進(jìn)行氧化酶和厭氧葡萄糖管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定生化管，置37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 PCR實(shí)驗(yàn):挑取單菌落接種于5 mL TSA培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)，1 000 r/min離心菌液，ddH2O洗滌2次，煮沸法提取DNA。引物及PCR反應(yīng)條件參照相關(guān)文獻(xiàn)［3］，觀察結(jié)果。

1.2.4 藥敏實(shí)驗(yàn):將分離純化的細(xì)菌接種于TSB培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h，用0.9%NaCl做10倍稀釋梯度稀釋，稀釋度為10－6、10－7、10－8，每個(gè)稀釋度的菌液分別吸取1 mL均勻涂布于3個(gè)TSA平板，37℃恒溫培養(yǎng)18 h后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平皿中菌落總數(shù)。將計(jì)數(shù)后菌落按1×10－8CFU/mL均勻涂布在2個(gè)TSA平板中，每個(gè)平板滴加0.1 mL菌液，用涂抹棒涂勻，用無菌鑷子將慶大霉素等10種常用抗菌藥物的藥敏紙片緊貼于瓊脂表面，置37℃恒溫箱內(nèi)18 h，觀察結(jié)果。

1.2.5 動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn):將分離純化的細(xì)菌接種于TSB，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h，將計(jì)數(shù)后的菌液做10倍稀釋梯度稀釋。取21日齡健康雛雞18只，分為6個(gè)組，每組3只。1～5組分別肌肉注射10－1、10－2、10－3、10－4、10－5稀釋TSA菌液，每只0.1 mL。第6組腹腔接種等量的滅菌生理鹽水作對(duì)照組。分別隔離飼養(yǎng)觀察，死亡后剖檢觀察病理變化，無菌采集肝臟病樣劃線接種于TSA平板，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣品解剖剖檢病雞可見胸腔積液，腹水;肝臟有白色壞死點(diǎn);心包粘連、積水，心臟有白色壞死點(diǎn);十二指腸有出血點(diǎn);喉管出血。無菌采集病雞心、肝、脾和全血。

2.2 細(xì)菌分離從心、肝、脾和全血中分離出形態(tài)大小一致的單一菌落，在血瓊脂平板、TSA平板中的菌落形態(tài)為針尖大小、灰白色、露珠狀小菌落，無溶血現(xiàn)象(見圖1);在麥康凱平板中無菌落生長(zhǎng)。經(jīng)鏡檢為革蘭氏陰性菌(染色呈紅色)，呈球桿或短桿狀。

圖1 TSA平板菌落生長(zhǎng)特征

2.3 生化試驗(yàn)從表1可以看出，硝酸鹽、靛基質(zhì)、蔗糖、木糖、葡萄糖和氧化酶為陽性;厭氧葡萄糖發(fā)酵、精氨酸、鳥氨酸等為陰性。鑒定編碼為02253，即多殺性巴氏桿菌。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.4 PCR鑒定結(jié)果PCR電泳結(jié)果顯示條帶大小在450 bp左右，與預(yù)期大小一致，陰性對(duì)照無條帶(見圖2)。

圖2 PCR電泳結(jié)果

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果:菌液含量為1.97×108CFU/mL。按1×108CFU/mL涂布于平板中，結(jié)果見表2，分離出的多殺性巴氏桿菌對(duì)慶大霉素、米諾環(huán)素中度敏感，對(duì)其他藥物不敏感。

2.6 動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)1、2組雛雞于24 h內(nèi)全部死亡，3組于24～48 h死亡1只，死亡雛雞剖檢可見肝臟表面有明顯灰白色壞死點(diǎn)，部分雞心臟有出血點(diǎn);4、5組雛雞飼養(yǎng)3天全部存活，剖檢無病理變化;注入無菌生理鹽水的對(duì)照組雛雞飼養(yǎng)3 d后全部存活，剖檢無病理變化。從死亡雞肝臟無菌接種菌至TSA平板中，分離菌與感染菌株形態(tài)特征、染色鏡檢結(jié)果一致。

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)病雞的心、肝、脾和全血進(jìn)行細(xì)菌分離、純化培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)和PCR鑒定，結(jié)果顯示分離菌株為多殺性巴氏桿菌。動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)表明，從接種死亡雞的肝臟中能回收到接種菌，說明多殺性巴氏桿菌為該場(chǎng)雞群死亡的主要病原菌。藥敏實(shí)驗(yàn)表明該菌對(duì)慶大霉素、米諾環(huán)素中度敏感，對(duì)其他常用于治療禽多殺性巴氏桿菌病的藥物耐藥，推測(cè)該場(chǎng)長(zhǎng)期使用環(huán)丙沙星等多種抗生素藥物，導(dǎo)致此病菌株耐藥性較高，該場(chǎng)用慶大霉素飲水給藥1周后開始好轉(zhuǎn)，疫情得到控制。隨著抗生素藥物的廣泛應(yīng)用，在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中長(zhǎng)期使用一種或多種抗生素，導(dǎo)致多重耐藥菌株出現(xiàn)［4］。一旦暴發(fā)疫病，藥物治療效果不佳，且造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，因此規(guī)?；曫B(yǎng)需重視抗生素的合理使用。

［1］Swayne D E，Glisson J R，Mcdogald L R，et al.Diseases of Poultry［M］.13th ed.Ames，Iowa，USA and Oxford，UK:Wiley－Blackwel，2013:807－823.

［2］廖素環(huán)，韋天超，騫慧，等.一起火雞禽霍亂的診治［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2011(8):36－37.

［3］閆瑞雪，羅青平，汪輝，等.禽多殺性巴氏桿菌PCR檢測(cè)方法的初步建立［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2015，36(2):5－7.

［4］幺乃全，李斯齊，邸海洋，等.火雞多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及致病性研究［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46(2):242－246.

Isolation，Identification and Drug Susceptibility Test of An Avian Pasteurella Multocida

Xu Yu，F(xiàn)eng Mingxiang，Wei Dengxiong，Chen Ying，Liu Ping，Yang Hejun，Chen Yongcui
(Guanling County Center of Animal Disease Control and Prevention，Guanling Guizhou 561300，China)

In order to determine the main pathogenic bacteria types which lead the death of an avian farm in anshun，Guizhou province.The heart，liver and spleen of avian was inoculated in avian blood nutrient agar plate，TSA plate and general nutrition agar plate respectively，from which then was isolated and purified.Dased on gram stain，biochemical test，PCR test，drug susceptibility test and pathogenic experiments on animals，the results showed that the isolated bacteria was Pasteurella multocida，which was medium sensitive to gentamicin and minocycline，but was not sensitive to ciprofloxacin，norfloxacin and so on.Conclusion:the experiment was successfully isolated an avian Pasteurella multocida.According to the result of the drug susceptibility test，the ill avian was controlled and recovered.

Pasteurella Multocida;Isolation;Identification;Drug Susceptibility Test

S858.31

B

1007－1474(2016)05－0016－03

2016－07－26

關(guān)嶺自治縣科技計(jì)劃項(xiàng)目

徐雨(1989—)，女，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。

E－mail:893248907@qq.com