陳錫龍

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州 貴陽 550003)

高效液相色譜柱的管理、維護、再生及修復技術

陳錫龍

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州 貴陽 550003)

為加強和規(guī)范高效液相色譜柱的管理和維護，延長色譜柱的使用壽命，提高檢測分析的工作效率，文章對高效液相色譜柱的實驗室規(guī)范性管理進行了探討。首先對色譜柱類型作了簡要介紹，從流動相、樣品及固定相3個方面詳細分析了影響色譜柱使用壽命的原因。再從色譜柱檔案的建立、分類存放、領用、啟用、柱效評價、故障判斷、適用范圍信息積累、維護和再生、修復以及報廢共10個方面建立了色譜柱實驗室管理工作的一般流程。

高效液相色譜柱;管理;維護;再生;修復;技術

高效液相色譜法(HPLC)是20世紀60年代末期發(fā)展起來的新型分離分析技術［1］。液相色譜法是指流動相為液相的色譜技術，在經典的液相色譜法基礎上，引入氣相色譜法理論，在技術上采用了高壓輸液泵、高靈敏度的檢測器和高效微粒固定相，實現(xiàn)了分析速度快、分析效率高和操作自動化，具有高壓、高速、高效和高靈敏度等特點。其工作原理是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相系統(tǒng)泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入供試品，由流動相帶入色譜柱，在柱內各成分被分離后依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄［2］，通過對色譜信號數(shù)據(jù)信息的處理，從而實現(xiàn)對樣品的定量及定性分析。高效液相色譜柱是高效液相色譜儀的心臟［3］，在高效液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性，延長色譜柱的使用壽命非常重要。色譜柱使用一段時間后會出現(xiàn)柱升高、柱效降低、峰形崎變和分離度降低、保留時間改變等變化，如不采取措施，將會縮短色譜柱的使用壽命，影響工作效率，并造成一定的經濟損失。因此，有必要加強和規(guī)范色譜柱的管理和維護，同時，也需要了解和掌握一些基本的色譜柱再生和修復技術，從而極大地延長色譜柱的使用壽命，提高檢測分析的工作效率。

本文從高效液相色譜柱管理的角度，以HPLC法在檢測分析中的實踐活動為基礎，以規(guī)范色譜柱的使用和維護，保證高效液相色譜分析的工作質量為出發(fā)點，從色譜柱檔案建立、存放、領用、啟用、柱效評價、故障判斷、適用范圍信息的積累、色譜柱的維護和再生、修復以及報廢10個方面，探討色譜分析實驗室對于色譜柱的分類管理，摸索高效液相色譜柱有序、有效使用的管理方法，并建立了規(guī)范管理的一般工作程序。

1 色譜柱的類型

色譜柱有多種不同的分類方法，根據(jù)固定相極性的不同可分為極性色譜柱和非極性色譜柱;根據(jù)固定相和流動相的相對極性的不同可分為正相色譜柱和反相色譜柱;根據(jù)色譜柱填充劑的差別可分為硅膠柱、化學鍵合硅膠柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱、玻璃微球柱等。在化學鍵合硅膠柱中以十八烷基鍵合硅膠柱應用最廣泛，辛基硅烷鍵合硅膠柱次之，即通常所說的C18和C8柱，胺基柱、腈基柱和苯基柱也偶有使用。

2 影響色譜柱使用壽命的因素

2.1 流動相用作流動相的溶劑應與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性;所用溶劑應有高純度，以防所含微量雜質在色譜柱中積累，引起柱性能的下降。以水溶液為流動相時，水溶液中的微生物(例如細菌、藻類和霉菌等)極易生長繁殖，這些微生物可能會堵塞固定相顆粒間的空隙，所以純水溶液流動相在室溫下最多使用時間不能超過48小時，如果需要短期保存，可以加入5%～10%的乙腈、甲醇等有機溶劑。目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10 μm，流動相中的細小顆粒雜質很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動相的pH值對色譜柱也有影響，特別是對化學鍵合硅膠填料，水溶液的pH值最適范圍在2.0～8.0之間，當pH＞8.5時會引起基體硅膠溶解，并生成絮狀物堵塞柱子。當pH＜1.0時，鍵合的硅烷會被水解并從柱中洗脫下來。這兩種情形造成的損壞很難復原，柱效會很快下降甚至完全失效。當緩沖液中加入有機溶劑(例如甲醇或乙腈)時，鹽類的溶解度下降，會析出鹽沉淀堵塞柱子。同時，流動相中的有機溶劑和鹽會腐蝕色譜柱柱頭上的篩板，產生柱頭凹陷。流動相的極性對柱子也有影響，對于硅膠柱，甲醇、水、冰乙酸等極性較大的物質會破壞填料;反之，對于化學鍵合硅膠柱，極性小的物質(如正丁醇、二氯甲烷等)也起到破壞作用。堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱，酸性溶液則會破壞陰離子交換樹脂柱。

2.2 樣品由于被分析樣品種類繁多，加之樣品基質復雜，色譜柱極易被污染，是導致柱壓升高、分離效能下降的原因之一。通常，樣品中含有一些對分析不利的物質，這些非目標物能夠被檢測器檢測到而形成色譜峰、氣泡、基線漂移或負峰。其中保留值弱的物質，一般能快速從色譜柱洗脫出來，對分析不產生干擾;中等保留強度的雜質能被緩慢沖洗出來，可對分析產生一定的干擾;強保留雜質通常難以被洗脫，多次上樣后，聚集在柱頭或色譜柱中，有的分析物甚至可能在通過色譜柱時與固定相發(fā)生作用，這些被吸附的雜質累積到一定程度后會形成新的偽固定相，從而改變色譜柱的性能。對于基質復雜的樣品，1根色譜柱的使用壽命可能只有百余次，而且每種色譜柱適用的樣品有限，1次錯誤的進樣甚至可能導致色譜柱失效［4］。

2.3 固定相生成硅膠材料的純度、微量金屬的含量、硅醇基的活性，都可能影響硅膠固定相的色譜行為(如不同色譜柱之間和不同批號產品之間的重復性)，其中硅膠表面的硅醇基在色譜行為中起著關鍵作用。硅膠表面的硅醇基與堿性化合物反應可導致峰形拖尾和色譜分離度的損失。硅膠中含有的痕量金屬雜質，是引起色譜峰形拖尾和柱效損失的另一個因素。樣品中的一些組分還會同固定相產生反應，特別是胺基柱表現(xiàn)最為明顯，因為胺基易與醛、酮的羰基反應形成席夫(Schiff)堿而減少活性點，使樣品的保留時間縮短。因此，胺基柱不能用于分析含羰基的化合物(如甾酮、還原糖等)［5］。色譜柱鍵合相基團脫落、固定相分解和活性基團變性等會影響柱效并使保留時間發(fā)生顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過硅氧硅鍵連接在硅膠基質上，形成帶有有機基團的固定相，硅氧硅鍵可能在水溶液中水解斷裂，從而使鍵合基團脫落。

3 高效液相色譜柱的管理

3.1 色譜柱檔案的建立色譜柱應統(tǒng)一編號，并建立紙質和電子版檔案，色譜柱信息應盡可能填寫完備以便建立色譜柱的適用信息的積累。內容包括:色譜柱編號、生產廠家、品牌、填料、型號、規(guī)格、運輸中的溶劑、最大耐壓、最大流速、使用溫度、pH范圍、注意事項、序列號、購進時間、單價、備注等。色譜柱使用信息可參照色譜柱包裝內的說明書或官方網站提供的相關說明。

3.2 色譜柱分類存放不同類型的色譜柱應分類存放以方便管理。硅膠柱、化學鍵合硅膠柱、氰基柱或胺基柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱各用1個專用色譜柱盒存放，盒上貼標簽，注明類別。隨柱說明書裝入密封袋附在登記本上。每啟用1根色譜柱，在色譜柱上貼上標簽，注明啟用日期。對于已經失效的色譜柱，經質量管理員評估后認為確需報廢的應做好報廢記錄。報廢后的色譜柱不能隨意丟棄，應專門存放。如果在用色譜柱需要進行修復，可以使用報廢柱的填料填充。

3.3 色譜柱領用檢驗員根據(jù)需要向色譜柱管理員申請領用色譜柱，色譜柱管理員應在電子檔案上登記領用日期、領用人及歸還日期以便追溯。

3.4 色譜柱的啟用首次啟用色譜柱時應記錄并妥善保存使用新色譜柱時的基本信息及各項性能指標，以便為以后進行柱效評價提供參考依據(jù)。記錄使用新色譜柱時的基本信息包括色譜柱、測試樣品的基本信息及測試條件3個方面的內容。色譜柱的基本信息應記錄:色譜柱的序列號、品牌名稱、規(guī)格型號、死體積等。測試樣品基本信息主要記錄:樣品名稱、含量、進樣體積等。測試條件記錄:流動相名稱及比例、檢測波長、流速、柱溫、柱壓等。色譜柱性能指標主要記錄:容量因子、峰面積、峰高、峰寬、對稱因子用理論塔板數(shù)等。首次啟用新色譜柱時建議用其對比較穩(wěn)定的標準樣品進行分析。記錄測試條件和譔色譜柱各項性能指標，有利于以后進行平行比較，評價色譜性能變化。例如某次啟用某一新色譜柱時所記錄的基本信息及其性能指標為:(1)色譜柱基本信息:品牌:Agilent;型號:ZORBAX SB－C18;系列號:USCL056891;長度:250 mm;內徑:4.6 mm;粒徑:5 μm;死體積:60.0%。(2)測試樣品:阿莫西林對照品;含量(濃度):0.447 5 mg/mL(折合凈含量);進樣量:20 μL;測試時間:20151126。(3)測試條件:流動相:0.05 M KH2PO4(用磷酸調節(jié)pH至5.0)－乙腈=97.5︰2.5;檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;壓力:97 Bar。(4)性能指標:容量因子(k’):4.85;峰面積:142 6.75;峰高:102.33;對稱因子:1.12;峰寬:0.212 2;理論板數(shù):9 433。

3.5 柱效評價所謂柱效評價就是考察色譜柱在使用前及使用過程中的各項性能指標，充分了解其分離能力的變化情況，以便順利完成分析測試任務。液相色譜柱的性能指標包括在一定實驗條件下的柱壓、理論塔板數(shù)、容量因子、對稱因子和相鄰組分的分離度等。新購色譜柱包裝內一般均附有出廠時色譜柱柱效評價報告，一般采用尿嘧啶、領苯二甲酸甲酯、二苯胺、萘、芴［6］、苯酚、硝基苯、甲苯等幾種化合物作為混合標準品，考察幾種物質的容量因子、理論板數(shù)、分離度、拖尾因子等。色譜柱使用一段時間后，也應對色譜柱的柱效進行評價?？刹捎蒙鲜鰩追N物質中的數(shù)種作混標溶液進行評價，也可以采用經常檢驗的性質較穩(wěn)定的樣品進行評價，記錄色譜圖和相關信息。內容應包括:色譜柱序列號、測試樣品名稱含量、測試條件、柱效、使用日期、備注等。了解新色譜柱的各項性能指標，方便以后進行平行比較，評價色譜柱的性能變化。使用常檢樣品對色譜柱進行柱效評價是一個實用且便利的方法，但是對于缺少前期實驗數(shù)據(jù)的色譜柱，則宜采用規(guī)范的混合標準物質進行評價。比較直觀的方法是考察峰高、峰寬及峰形拖尾的情況，最簡單而有效的方法是考察理論塔板數(shù)的下降情況。一般理論板數(shù)下降50%時應及時對色譜柱進行再生處理［7］。

3.6 色譜柱故障判斷在檢驗中發(fā)現(xiàn)，色譜柱柱效下降體現(xiàn)在色譜圖上主要表現(xiàn)為6種峰形，分別為峰形加寬變形、峰形變粗、嚴重拖尾、出現(xiàn)肩峰、峰尖分叉(雙峰)及峰形畸變，分別見圖1～圖6。一般而言，前3種情形受到污染的情況比較輕微，經過再生即可大大提高柱效。出現(xiàn)第4種峰形一般是由于色譜柱受污染較為嚴重，如果是發(fā)生在初期，通過再生清洗也能夠恢復大部分柱效，如果長時間未進行處理，污染物與固定相已經牢固結合，則不能通過再生進行恢復，而只能通過清除被污染的固定相來進行修復了。出現(xiàn)第5種峰形一般是色譜柱柱頭塌陷所致。第6種情形是本應為單一的色譜峰卻畸變?yōu)槎鄠€色譜峰，這是污染非常嚴重造成的。柱頭塌陷和嚴重污染均不能通過再生恢復柱效，只能通過物理方法進行修復。

圖1 峰形加寬變形色譜圖

圖2 峰形變粗色譜圖

圖3 峰形嚴重拖尾色譜圖

圖4 出現(xiàn)肩峰色譜圖

圖5 峰尖分叉(雙峰)色譜圖

圖6 峰形畸變色譜圖

3.7 色譜柱適用范圍信息積累由色譜柱管理員定期更新，并按照色譜柱品牌和型號進行分類整理，按照色譜柱類型、填料和采用的流動相對分析品種進行匯總分類，對于色譜柱不適用品種進行標注并分析原因，歸納總結。色譜柱適用范圍信息的積累對于色譜柱的選擇指導意義，能提高具體品種方法開發(fā)和分析的效率。

3.8 色譜柱的維護和再生

3.8.1 色譜柱應輕拿輕放，避免碰撞、振動和跌落;放置和歸還時檢測員應確認保存在合適的溶劑之中，并確認色譜柱兩端的堵頭已旋緊。經驗表明，使用高級別的有機溶劑及實驗用水對于維護色譜柱的性能具有關鍵性作用。高效液相色譜實驗中所使用的有機試劑必須達到色譜純級別;實驗用水［8］須為GB/T 6682—2008或ISO 3696:1987，MOD規(guī)定的一級水，當實驗室受條件限制不能自行制備一級水時，經驗上的做法是可以使用娃哈哈公司生產的飲用純凈水替代。

色譜柱壓力升高時，可采用下述方法處理:(1)使用比當前使用的流動相對樣品溶解能力更強的試劑清洗色譜柱;(2)將色譜柱反向連接沖洗(反接色譜柱時，應確保色譜柱允許反接);(3)將色譜柱柱頭的篩板拆卸超聲清洗后再安裝使用。

3.8.2 色譜柱的再生:當色譜柱出現(xiàn)峰高降低、峰寬加大等比較明顯的柱效下降情況，特別是理論板數(shù)下降超過50%以上，或者出現(xiàn)肩峰影響定量計算結果時，應及時對色譜柱進行再生處理。色譜柱再生應在色譜柱檔案中注明。再生原則如下:(1)反相柱的再生:采用甲醇∶水=95∶5(V∶V)，純甲醇、二氯甲烷等溶劑作流動相，順次沖洗，每種流動相經色譜柱的量為20～30倍柱體積，然后再用相反順序沖洗色譜柱。(2)正相柱的再生:順次用20～30倍柱體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。由于異丙醇的黏度較大，沖洗時應將流速調到0.2 mL/min，以免柱壓過大沖壞色譜柱。

3.9 色譜柱的修復當色譜柱出現(xiàn)柱頭塌陷或嚴重污染無法進行再生時，可挖掉被污染部分的固定相(長度一般不超過2 cm，且絕大多數(shù)可從顏色上進行區(qū)分，被污染的固定相靠柱頭端及柱壁部分一般呈黑褐色)，再重新填充同樣的近干燥的固定相，用少量流動相濕潤，再填充干燥的固定相與柱口齊平(必要時用光滑的不銹鋼棒壓緊)，如此重復3～5次。然后重新安裝色譜柱，連接高壓泵，用流動相沖洗并保持一定壓力?？芍貜蜕鲜鲞^程多次直至修復成功。色譜柱的再生和修復工作繁瑣耗時且需要具備一定的專業(yè)技巧，建議應由專業(yè)的技術人員或者專門的服務機構來處理。

3.10 色譜柱的報廢對于確已失效的色譜柱，經質量管理員評估后認為確需報廢的應做好報廢記錄。報廢后的色譜柱也應專門存放，以便將來可以利用其填料修復被嚴重污染的色譜柱。

4 小結

高效液相色譜柱是檢測分析機構的寶貴資源，色譜柱的管理、維護、再生及修復技術在檢測分析工作中具有舉足輕重的作用。良好的管理、正確的維護能夠提高色譜柱的使用效率，節(jié)約分析時間，而掌握一定的再生及修復技術則可以延長色譜柱的使用壽命，有利于降低檢測分析的成本。

［1］于世林.高效液相色譜方法及應用:第2版［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:1.

［2］謝虹，劉秋朝，梁建生，等.高效液相色譜柱的管理［J］.實驗室研究與探索，2003，22(3):117－125.

［3］劉翻，熊志超，張凌怡，等.高效液相色譜柱清洗與再生方法［J］.分析測試技術與儀器，2010，16(2):71－77.

［4］鄭偉，孫東方.高效液相色譜柱的選擇、使用與維護［J］.口腔護理用品工業(yè)，2011，21(6):37－39.

［5］于世林.高效液相色譜方法及應用:第2版［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:79.

［6］林蘭，程奇蕾，寧保明，等.淺談分析實驗室高效液相色譜柱的管理［J］.中國藥師，2014，17(11):1972－1973.

［7］于世林.高效液相色譜方法及應用:第2版［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:314.

［8］中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法［S］.北京:中國標準出版社，2008:1.

Technology of Repairing，Cleaning，Maintaining and Managing Chromatographic Column for HPLC

Chen Xilong
(Guizhou Provincial Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feeds，Guiyang Guizhou 550003，China)

It is studied on standard management of chromatographic columns in a quality testing lab，referring to practical works in test and other people’s research，so that columns can be maintained properly and used much longer time.This article introduces classification of columns briefly at first，and then analyzed mobile phase，samples，and stationary phase that influence life－time of a column.A standard procedure is set up on how to register，store，get，use，maintain，clean，repair or discard a column，evaluate its performance，decide its conditions，or gather its usage information.

Technology;Repair;Clean;Maintain;Manage;Chromatographic Column;HPLC

O657.7

A

1007－1474(2016)05－0023－05

2016－07－15

陳錫龍(1969—)，男，高級獸醫(yī)師，從事獸藥質量檢驗檢測及相關研究工作。E－mail:cxlofyjs@163.com