趙雪松　樊永平　陳志剛　高　芳

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科,北京,100050; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院東方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京,100078)

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三七總皂苷對腦出血大鼠神經(jīng)功能及腦含水量的影響

趙雪松1樊永平1陳志剛2高芳2

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科,北京,100050; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院東方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京,100078)

目的:研究三七總皂苷對腦出血大鼠神經(jīng)功能及腦含水量的影響。方法:實驗用健康Sprague-Dawley(SD)同系雄性大鼠350只,體重230～250 g,大鼠隨機分為假手術(shù)組(簡稱CG),模型組(簡稱MG),用藥組(簡稱TG)3個組,每組分6 h、24 h、48 h、72 h、7 d,5個時間點。造模用Ⅳ型膠原酶注入尾殼核,治療組給予三七總皂苷腹腔注射,1次/d。在相應(yīng)時間點,采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(Modified Neurological Severity Score,mNSS)對各時間點神經(jīng)功能缺損進行評價。結(jié)果:各時間點MG mNSS和CG比明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，除6 h外,各時間點MG和TG比,TG mNSS明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各時間點MG腦含水量和CG比明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，除6 h、7 d外,各時間點MG和TG比,TG腦含水量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:腦出血模型組中,6 h開始,mNSS和腦含水量明顯增高,到48 h達到高峰,以后逐漸下降,三七總皂苷可以明顯下調(diào) mNSS評分和腦含水量。

三七總皂苷;腦出血;神經(jīng)功能;腦含水量

腦出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)是最危重的一種卒中類型,占所有卒中事件10%～25%[1]。ICH的病死率明顯高于缺血性卒中,直接病死率為38%～43%,病殘率為70%～80%,其復(fù)發(fā)率約為1.8%～11%[2-3]。ICH具有發(fā)病急、變化快、病情危重、病機復(fù)雜等特點,臨床必須緊急救治,故急性期救治對提高搶救成功率和患者的生活質(zhì)量具有重要意義。目前關(guān)于ICH急性期的治療無突破性的進展,尤其是內(nèi)科治療,多限于脫水降顱壓、調(diào)整血壓、改善營養(yǎng)代謝和防治并發(fā)癥等對癥及支持療法,缺乏針對性強、有效的治療手段,多數(shù)ICH患者都留下神經(jīng)功能缺損。ICH后腦損傷的機制很多,包括血腫的擴大、血腫周圍組織缺血(缺血性半暗帶)、血腫周圍組織腦水腫等,在血腫形成過程中和形成后,都存在腦水腫,腦水腫具有神經(jīng)毒性,破壞神經(jīng)的正常功能[4]。本研究通過三七總皂苷對腦出血大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量的影響,探討其對腦出血的治療作用。

1　材料與方法

1.1試劑與動物模型的制備

1.1.1實驗動物與分組實驗用健康Sprague-Dawley(SD)同系雄性大鼠350只,體重230～250 g,動物許可證號是SCXK(京)2012-0001,實驗動物全部從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買。動物每籠10只群養(yǎng),飼養(yǎng)于普通級動物房,室內(nèi)溫度保持為(22±2)℃,相對濕度保持為30%～40%。各組大鼠常規(guī)飼料,自由進食飲水。

1.1.2主要實驗設(shè)備及試劑立體定位儀(Model310),日本stoelting公司,Ⅳ型膠原酶,sigma公司,貨號C-5138,三七總皂苷,廣西梧州制藥集團股份有限公司,電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9145A型),上海一恒科技有限公司,離心機(Eppendorf Centrifuge 5810R),德國EPPENDORF公司,微量進樣器,上海安亭器械廠,水合氯醛(批號20111024),國家集團化學(xué)試劑有限公司,精密電子天平(1/1000,A2005),Saitorius公司,超低溫冰箱(MDF-U32V),SANYO公司。

1.1.3動物模型制作及給藥腦出血大鼠動物模型參考了Rosenberg等提出的方法進行制備。術(shù)前準(zhǔn)備:首先大鼠在造模前8 h采取禁食和禁水措施,其次把配置好的麻藥(10%水合氯醛)、手術(shù)器械、立體定位儀、冰塊、藥品等準(zhǔn)備好,最后用醫(yī)用生理鹽水洗滌微量進樣器數(shù)遍,直到管壁光滑,針頭沒有存留雜物。造模過程:1)稱重,然后按每100 g體重0.4 mL的比例腹腔注射麻醉,麻藥給藥后,大約5～10 min麻醉完成。2)給實驗大鼠頭部備皮,沿頭顱正中部切開皮膚,向左右分開皮膚,用棉球擦掉骨膜,如出血,按壓止血,充分暴露前囪,接著用微量進樣器抽取配置好的膠原酶溶液(每1 μL溶液含Ⅳ型膠原酶0.2 U),把微量進樣器和大鼠分別固定于立體定位儀上。3)參照大鼠腦立體定位圖譜,右側(cè)尾殼核體表位于前囟右3 mm后1 mm處,微量進樣器針頭對準(zhǔn)前囟,調(diào)節(jié)旋鈕,向后移動3 mm,向后移動1 mm,記號筆標(biāo)記此點,然后用顱骨鉆鉆開顱骨,再向下移動5.5 mm,啟動微量進樣器,把2 μL膠原酶勻速緩慢打入尾殼核(模型組和用藥組老鼠),假手術(shù)組則用微量進樣器打入2 μL滅菌生理鹽水,留針5 min,緩慢退出微量進樣器,切口撒適量青霉素鉀粉,縫合傷口回籠飼養(yǎng)。

本實驗采用的藥物是三七總皂苷的成品藥物血栓通針粉,各組實驗大鼠分為6 h,24 h,48 h,72 h,7 d,5個時間點,給藥根據(jù)時間點的不同而不同。生理鹽水和血栓通針粉都通過腹腔注射給藥,生理鹽水給藥量為每100 g體重1 mm,血栓通給藥量為每100 g體重0.72 mL,配置時溶液中含有10 mg/mL血栓通。6 h時間點的假手術(shù)組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,6 h后取材。24 h時間點的假手術(shù)組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后取材。48 h時間點的假手術(shù)組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后各組再注射1次,造模后48 h取材。72 h時間點的假手術(shù)組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后各組再注射1次,48 h后各組再注射1次,造模后72 h取材。7 d時間點的假手術(shù)組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后各組再注射1次,48 h后各組再注射1次,72 h后各組再注射1次,4 d后各組再注射1次,5 d后各組再注射1次,6 d后各組再注射1次,造模后7 d取材。

表1　改良的神經(jīng)功能缺損評分表

1.2實驗方法

1.2.1mNSS評分神經(jīng)功能改良的神經(jīng)功能缺損評分(Modified Neurological Severity Score,mNSS)評定神經(jīng)功能。將每組各時間點大鼠在相應(yīng)時間點做mNSS評分,mNSS是目前國際上公認的大鼠腦卒中后神經(jīng)功能缺失評判標(biāo)準(zhǔn),主要包括提尾反射、行走測試、感覺測試、平衡測試、反射缺失和反常運動。最大得分為18分,缺少一項反射或動物不能完成一項任務(wù)給1分,輕型傷:1～6分;中型傷:7～12分;重型傷:13～18分。評定指標(biāo)及方法見表1。

1.2.2腦含水量測定于相應(yīng)時間點麻醉大鼠后,斷頭取腦,立即稱重并記錄每只大鼠鼠腦的濕重,用錫箔紙包裹,并標(biāo)號,然后放入-70 ℃冰箱凍存,集中放入110 ℃恒溫箱中烘干至恒重,24 h后取出立即稱取干重。

2　結(jié)果

2.1mNSS評分測定假手術(shù)組注射生理鹽水對大鼠腦組織有損傷,動物干預(yù)后會存在短時的神經(jīng)功能障礙,24 h時神經(jīng)功能恢復(fù)正常;腦出血組神經(jīng)功能評分較高,在48 h時神經(jīng)功能缺失最重,同假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);治療組運動、感覺、平衡以及反射4個方面缺失程度減輕,mNSS神經(jīng)功能評分明顯低于腦出血組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

2.2腦含水量測定腦含水量按Billiot公式計算,腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。與假手術(shù)組比較,模型組各時間點腦含水量變化明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組腦含水量6 h開始升高,48 h達到高峰,以后逐漸下降。除6 h、7 d外,其余各時間點模型組和用藥組比較,用藥組腦含水量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表2　三七總皂苷干預(yù)腦出血大鼠后mNSS評分的變化±s)

注:假手術(shù)組簡稱CG;模型組簡稱MG;用藥組簡稱TG;相應(yīng)時間點與假手術(shù)組比較,*P<0.05,與模型組比較,△P<0.05。

表3　三七總皂苷干預(yù)腦出血大鼠后腦含水量的變化±s,%)

注:假手術(shù)組簡稱CG;模型組簡稱MG;用藥組簡稱TG;相應(yīng)時間點與假手術(shù)組比較,*P<0.05,與模型組比較,△P<0.05。

圖1　三七總皂苷干預(yù)腦出血大鼠后mNSS評分的變化

注：相應(yīng)時間點與假手術(shù)組比較,△P<0.05,與模型組比較,*P<0.05。

圖2　三七總皂苷干預(yù)腦出血大鼠后腦含水量的變化

注：相應(yīng)時間點與假手術(shù)組比較,△P<0.05,與模型組比較,*P<0.05。

3　討論

ICH后的神經(jīng)損害主要分為兩方面,其一是血腫擴大及占位效應(yīng)引發(fā)的原發(fā)性損傷,其二是腦水腫,炎性反應(yīng)所致的繼發(fā)性神經(jīng)損傷,原發(fā)性損傷往往不可逆,繼發(fā)性損傷是可以減輕的。腦出血后腦水腫和炎性反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷的主要原因,研究發(fā)現(xiàn)凝血酶在繼發(fā)性腦損傷中扮演著重要角色,它與par-1、NMDANR、MMP-9和NF-κB相互作用,誘發(fā)腦水腫和炎性反應(yīng),加重腦損傷。腦出血后血腫壓迫微循環(huán)引起的周圍組織缺血、缺氧[5],凝血酶激活,進一步破壞血腦屏障完整性,白細胞在腦組織中聚集并誘導(dǎo)某些活性物質(zhì)如MMP-9、TNF-α釋放[6],興奮性氨基酸與細胞的特異性受體相結(jié)合,引起細胞能量需求增加等都可以誘發(fā)加重腦水腫[7]。腦出血屬于中醫(yī)學(xué)的中風(fēng)病,其基本病理演變?yōu)轲鲅铚?脈絡(luò)不暢,日久化毒;毒留脈內(nèi),日久化火,灼傷脈絡(luò),或毒邪傷絡(luò),血溢成瘀,或毒邪傷津,血滯為瘀,瘀毒互彰,毒損腦髓,髓損神傷,終致神明受擾,神機失用,昏蒙昏饋,病機根本在于瘀血,治以活血化瘀,藥物選用中藥三七的提取物血栓通凍干粉,三七味寒、微苦,性溫,入肝、胃、大腸經(jīng),具有止血散瘀,消腫定痛的功效,止血而不留瘀。三七的活性成分為三七總皂苷,主要用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病,并有抗炎、改善腎功能等作用,可促進腦出血顱內(nèi)血腫的吸收、減輕腦水腫和炎性反應(yīng)、清除自由基、改善血腫周圍微循環(huán)、降低血腦屏障通透性以治療出血性中風(fēng),促進腦出血后神經(jīng)元的存活及損傷修復(fù)。

造模后,對實驗動物各時間點神經(jīng)功能缺損進行評價,假手術(shù)組注射生理鹽水對大鼠腦組織有損傷,實驗干預(yù)后會存在短時的神經(jīng)功能障礙,24 h時神經(jīng)功能恢復(fù)正常;腦出血組神經(jīng)功能評分較高,6 h開始到48 h逐漸升高,在48 h時達到峰值,神經(jīng)功能缺損最重,以后緩慢下降,模型組與假手術(shù)組比較,5個時間點均有差異統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),佐證了模型制作成功,說明腦出血發(fā)生后,神經(jīng)功能很快出現(xiàn)缺損,6 h即可見,變化呈先升后降趨勢,在48 h時達峰值。用藥組經(jīng)治療后,運動、感覺、平衡以及反射4個方面神經(jīng)功能缺失程度減輕,用藥組與模型組比較,神經(jīng)缺損評分比相應(yīng)時間點模型組都下降,除6 h組下降較小,差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P=0.228),其余各組神經(jīng)功能缺損評分較相應(yīng)時間點模型組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),6 h組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)可能是由于藥物沒有充分發(fā)揮作用所致,但是依據(jù)均值來看,用藥組比模型組下降,說明治療還是有效果的。其余各組mNSS評分明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明三七總皂苷對于減輕大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損是有效的,為臨床活血化瘀藥治療腦出血提供實驗依據(jù)。

采用Billiot公式計算腦含水量,腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%,假手術(shù)組注射生理鹽水對大鼠腦組織造成損傷,出現(xiàn)輕度的腦水腫,隨著時間的推移,基本呈減輕趨勢,在1周的時候減到最小。模型組大鼠腦含水量呈先升高后下降趨勢,在造模后6 h即出現(xiàn)腦水腫,以后急速升高,在48 h達到頂峰,從72 h開始逐漸下降,7 d時基本接近正常。假手術(shù)組和模型組比較,各時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明腦出血后腦水腫是一個非常普遍而且重要的變化,它對神經(jīng)功能產(chǎn)生了重大影響,也是我們關(guān)注的重點。用藥治療后,各時間點腦水腫都減輕,用藥組與模型組比較,6 h時間點雖然有下降,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.062),原因可能是由于藥物還沒有充分發(fā)揮作用,但是據(jù)實驗數(shù)據(jù)來看,用藥組比模型組下降,說明治療還是有效果的。24 h、48 h、72 h,3個時間點的模型組和用藥組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。7 d組用藥組與模型組比較,雖然腦水腫有所減輕,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.41),究其原因可能是第7天時,腦水腫原本就自發(fā)的緩解了,從實驗數(shù)據(jù)來看,用藥后對腦水腫起了下調(diào)作用,說明治療是有效的?？偟膩碚f,三七總皂苷對腦出血后腦水腫有治療作用,為臨床活血化瘀藥治療腦出血提供實驗依據(jù)。

[1]Lee JC,Cho GS,Choi BO,et al.Intracerebral hemorrhage-induced brain injury is aggravated in senescence accelerated pronemince[J].Stroke,2006,37(1):216-222.

[2]鄧寶康.臨床各科疑難病診治與康復(fù)[M].西安:世界圖書出版西安公司,2000:9.

[3]Passero S,Burgalassi L,DAndrea P,et al.Recurrence of bleeding in patients with Primarily intracerebral hemorrhage[J].Stroke,1995,26(7):1189-1192.

[4]Gong Y,Hua Y,Keep RF,et al.Intracerebral hemorrhage:effects of aging on brain edema and neurological deficits[J].Stroke,2004,35(11):2571-2575.

[5]呂田明,陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動脈血腦出血模型[J].J Apoplexyand Nervous Diseases,2006,23(1):88-90.

[6]Lee KR,Colon GP,Betz AL,et al.Edema from intracerebral hemorrhage:the role of thrombin[J].J Neurosurg,1996,84(1):91-96.

[7]尹匕,楊于嘉,虞佩蘭等.大鼠腦水腫腦組織谷氨酸與γ-氨基丁酸的改變及黃答試對其影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,20(7):524-526.

(2016-03-31收稿責(zé)任編輯：王明)

Panax Notoginseng Saponins′s Effect on Nerve Function and Cerebral Edema of Rats with Cerebral Hemorrhage

Zhao Xuesong1, Fan Yongping1, Chen Zhigang2, Gao Fang2

(1ChineseMedicineDepartment,BeijingTiantanHospitalaffiliatedCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China;2NeurologyDepartment,DongfangHospitalBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China)

Objective: To investigate the effects of Panax Notoginseng Saponins (PNS) on the neurological function and cerebral water content in the rats with cerebral hemorrhage. Methods: A total of 350 healthy homologous male SD rats, 230～250 g, were randomly divided into control group, model group and treatment group, and were observed at the following time points: 6 h, 24 h, 48 h, 72 h and 7days respectively. Rats model was established by Ⅳ collagenase type uniform slowly into the tail putamen hemorrhage. The treatment group were given intraperitoneal injection of PNS once a day. The Modified Neurological Severity Score (mNSS) of each group at the same time points was used to evaluate the nerve damage. Results: The mNSS of model group was significantly higher at every time point than the control group (P<0. 05). Except for 6 h, the mNSS of treatment group was significantly higher at the other time points than the other two groups (P<0. 05). The brain water content of the model group was significantly higher at every time point than the control group (P<0. 05). Except for the 6 h and 7d time point, the brain water content of the treatment group was significantly lower than the other two groups (P<0. 05). Conclusion: In the cerebral hemorrhage model groups, the mNSS and brain water significantly increased at 6 h, reached a peak at 48 h, then gradually declined. PNS can significantly decrease the mNSS scores and brain water content.

Panax Notoginseng Saponins; Cerebral hemorrhage; Nerve function; Brain water content

北京市中醫(yī)藥科技項目(編號:QN2014-17);首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院青年科研基金(編號:2014-YQN-YS-06)

趙雪松(1981.03—),男,醫(yī)學(xué)博士,住院醫(yī)師,研究方向:中醫(yī)內(nèi)科腦病,E-mail:65835337@qq.com

樊永平(1965.01—),男,醫(yī)學(xué)博士,主任醫(yī)師,科主任,研究方向:中醫(yī)治療腦病臨床和研究，Tel:(010)67096662,E-mail:yongpingf@hotmail.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.042