馮永增，王成貴，水小龍，余洋，蔡樂益，徐華梓

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，浙江 溫州 325000）

論著

V EGF-165/A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞復(fù)合多孔生物活性玻璃的生物相容性研究*

馮永增，王成貴，水小龍，余洋，蔡樂益，徐華梓

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，浙江 溫州 325000）

目的制備一種具有誘導(dǎo)血管再生活性的新型復(fù)合骨組織工程材料，并評(píng)價(jià)其生物相容性。方法將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-165（V E G F-165）/血管生成素-1（AN G-1）雙基因共轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（E P C s）復(fù)合多孔生物活性玻璃，制成復(fù)合人工骨材料。采用W e s t e r n blot、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（R T-P C R）檢測(cè)已轉(zhuǎn)染E P C s中V E G F-165及AN G-1的表達(dá)。噻唑藍(lán)（M TT）細(xì)胞毒性試驗(yàn)、骨植入試驗(yàn)及掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面黏附情況等綜合評(píng)價(jià)材料的生物相容性；C D31免疫組織化學(xué)法染色觀察材料中血管再生的情況。結(jié)果W e s t e r n blot檢測(cè)、R T-P C R反應(yīng)顯示，實(shí)驗(yàn)組V E G F-165、AN G-1的表達(dá)較對(duì)照組升高。M TT細(xì)胞毒性試驗(yàn)、骨植入試驗(yàn)均顯示，材料無(wú)毒性反應(yīng)。掃描電鏡顯示，材料表面有較多血管內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附，并有較多偽足伸出。蘇木精-伊紅染色法（H E）染色顯示，材料周圍組織生長(zhǎng)良好，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，材料與周圍組織交界處有大量的新骨生成。C D31免疫組織化學(xué)法染色顯示，材料中有較多新生的毛細(xì)血管。結(jié)論V E G F-165/AN G-1雙基因共轉(zhuǎn)染E P C s復(fù)合多孔生物活性玻璃的骨組織工程材料生物相容性良好，具備一定的誘導(dǎo)血管再生活性。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-165/血管生成素-1雙基因；生物活性玻璃；骨材料；生物相容性；血管再生

由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因造成的各種類型骨缺損是臨床上遇到的常見問題。研制出理想的骨修復(fù)材料一直是生物材料學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)努力探索的一個(gè)方向。生物活性玻璃作為一種新型的人工骨材料，因其具有良好的成骨誘導(dǎo)活性而被廣泛用于臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究，但血管化能力差，限制其在骨缺損修復(fù)中的推廣應(yīng)用［1］。轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題提供新的思路和方法［2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（v asc u lar endothelial g ro w th f actor，V E G F）是體內(nèi)促進(jìn)血管新生的最重要因子，而V E G F-165在V E G F家族中活性最強(qiáng)，分布范圍廣，是體內(nèi)發(fā)揮作用的主要形式。但V E G F誘導(dǎo)的新生血管結(jié)構(gòu)不完整，滲漏性強(qiáng)，易形成水腫，不成熟，血管多數(shù)難以發(fā)揮正常功能［3］。血管生成素-1（A n g iopoietin-1，A N G-1）能夠完成血管的精細(xì)結(jié)構(gòu)，促使血管成熟，有效防止炎癥及V E G F所致的血管通透性增加，減少滲出水腫等副反應(yīng)［4］。P ETE RS等［5］研究認(rèn)為，聯(lián)合應(yīng)用V E G F與A N G-1具有協(xié)同作用，不但可以促進(jìn)血管生成，而且會(huì)使新生血管結(jié)構(gòu)更成熟穩(wěn)定，功能更健全，促進(jìn)缺血心肌、肢體的血管再形成。

本研究將V E G F-165與A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial pro g enitor cells，E PC s）種植于多孔生物活性玻璃內(nèi)，以期制備一種具有誘導(dǎo)血管再生活性的骨組織工程材料，并通過細(xì)胞水平和動(dòng)物水平綜合評(píng)價(jià)其生物相容性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑、材料及動(dòng)物

4月齡新西蘭大耳兔14只，體重3.0～3.5 k g，雌雄不限（4只用于分離提取血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，10只用于骨植入實(shí)驗(yàn)）。

胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液、改良達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（d u lbecco's minim u m essential medi u m，D M E M）（美國(guó)G ibco公司），胰酶（美國(guó)G ibco公司），青鏈雙抗（北京L ea g ene公司），Tri z ol（美國(guó)I n v itrog en公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Ta K a R a公司），V E G F-165、A N G-1抗體（英國(guó)A bcam公司），C D31（美國(guó)R D S ystems公司），噻唑藍(lán)［3-（4，5-dimethyl-2-thia z olyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetra z oli u m bromide，M TT］試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所），A d. V E G F-165和A d.A N G-1腺病毒載體（北京諾賽公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料的制備及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使用磷酸三乙酯（triethyl phosphate，TE P）作為P2O5的前驅(qū)體，正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TE O S）作為S i O2的前驅(qū)體，硝酸鹽C a（N O3）2·4H2O，M g（N O3）2·6H2O作為堿金屬和堿土金屬氧化物的前驅(qū)體。TE O S和TE P在酸或堿的催化作用下在水溶液中進(jìn)行水解形成溶膠，然后加入C a（N O3）2·4H2O，M g（N O3）2·6H2O等均勻混合，陳化后得到凝膠，經(jīng)過干燥和煅燒后得到玻璃。最后切成5mm厚度的片狀，環(huán)氧乙烷消毒。掃描電子顯微鏡觀察復(fù)合材料的表面微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.2血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)本研究所采用的細(xì)胞為兔血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，其原代培養(yǎng)及鑒定參照相關(guān)文獻(xiàn)［6-7］，細(xì)胞密度＞80%后進(jìn)行傳代，每3 d換液1次。分別于第3和5天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1.2.3雙基因腺病毒載體的構(gòu)建及對(duì)兔E P C s的轉(zhuǎn)染構(gòu)建腺病毒載體 A d.V E G F-165和 A d. A N G-1，取培養(yǎng)的第3代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，胰酶消化后，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，置于5%二氧化碳C O2濃度，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以感染復(fù)數(shù)為100進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染E PC s。并將E PC s分為4組：V E G F-165及A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染組、V E G F-165單基因轉(zhuǎn)染組、A N G-1單基因轉(zhuǎn)染組、無(wú)轉(zhuǎn)染E PC s組。通過W estern blot檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（re v erse transcription-polymerasechainreaction，R T-PC R） 等 方 法 檢 測(cè)V E G F-165及A N G-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分泌。

1.2.4M TT細(xì)胞毒性試驗(yàn)將制備好的片狀材料浸沒于含10%胎牛血清、1%青鏈雙抗的D M E M培養(yǎng)基中，固液比例為0.2 g/ml，37℃浸提48 h，浸提液經(jīng)0.22μm過濾器過濾后置于4℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。將上?組E PC s分別接種于25mm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%C O2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用2.5%胰蛋白酶消化1～2min，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液。按2 000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板上，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，待細(xì)胞貼壁后去除原先的培養(yǎng)基，各組分別加入上述預(yù)先制備好的材料培養(yǎng)基浸提液。于接種后的第1、3和5天分別取出各一塊96孔板，每孔加入10μl M TT試劑，4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)570nm處的光密度。

1.2.5掃描電鏡將V E G F-165/A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染的E PC s，在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用2.5%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種于已制備好的多孔生物活性玻璃，并加入細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃，5%C O2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。取出骨材料，2.5%戊二醛固定，酒精及叔丁醇梯度脫水，離子濺射噴金，于掃描電鏡下觀察材料表面細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)狀況。

1.2.6骨植入試驗(yàn)取20只健康新西蘭大耳白兔，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。用10%水合氯醛（3m l/k g）腹腔麻醉后，于右側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)備皮，碘伏消毒后，暴露股骨外側(cè)髁，保護(hù)神經(jīng)和血管。剝離骨膜后于外側(cè)髁上以直徑5mm的鉆頭鉆孔，鉆入長(zhǎng)度為10mm。實(shí)驗(yàn)組植入轉(zhuǎn)染雙基因E PC s的復(fù)合材料，對(duì)照組植入無(wú)復(fù)合任何種子細(xì)胞的材料。然后逐層縫合切口。術(shù)后80萬(wàn)u青霉素抗感染3 d。各組分別于術(shù)后4和8周將5只兔子安樂死，取材做病理切片，蘇木精-伊紅（hemato x ylin-eosin，H E）染色法觀察新骨生長(zhǎng)及材料周邊的炎癥情況。C D31免疫組織化學(xué)法染色觀察材料中血管再生的情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩之間的多重比較用LS D-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1多孔生物活性玻璃的表面微觀結(jié)構(gòu)

制得的S i O2-C a O-M g O-P2O5多孔生物活性玻璃孔隙率在70%左右，而且孔徑大小為100～300μm，孔隙之間的連通性良好，具備種子細(xì)胞生長(zhǎng)的良好條件。見圖1。

2.2細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況

培養(yǎng)的第3天可見細(xì)胞基本貼壁并開始進(jìn)入增殖分裂。第5天細(xì)胞數(shù)量明顯增多，基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，可見細(xì)胞增殖旺盛，生長(zhǎng)狀況良好。見圖2。

2.3Wester n blot檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，V E G F-165及A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中A N G-1、V E G F-165的表達(dá)量均高于對(duì)照組。見圖3。

2.4RT-PCR反應(yīng)

圖1　電鏡觀察制備的S i O2-CaO-M g O-P2O5多孔結(jié)構(gòu)骨材料

圖2　細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況 （×200）

圖3　血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中A N G-1、V EGF-165翻譯水平的相對(duì)表達(dá)量

各組血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中V E G F-165和A N G-1的表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 9.419和28.413，P=0.003和0.000）。V E G F-165及A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中V E G F-165和A N G-1的表達(dá)量與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.260和-1.960，P=0.001和0.000），V E G F-165及A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中V E G F-165和A N G-1的表達(dá)量較對(duì)照組增高。見圖4。

2.5MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)

細(xì)胞接種后第1、3和5天進(jìn)行M TT檢測(cè)，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.420，P= 0.004），各組光密度值均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；②不同組別間的光密度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.358，P=0.098），表明各組細(xì)胞增殖能力一致。見附表和圖5。

2.6掃描電鏡

圖4　血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中V EGF-165、A N G-1轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量

掃描電鏡可見血管內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附在材料表面，形態(tài)飽滿，呈梭形，有較多的偽足伸出并相互連接融合。種植后第8與第4天掃描電鏡結(jié)果比較，可見血管內(nèi)皮祖細(xì)胞顯著增多，表明細(xì)胞與復(fù)合材料的生物相容性良好。見圖6。

2.7骨植入試驗(yàn)

圖5　各組細(xì)胞第1、3和5天MTT檢測(cè)結(jié)果的變化趨勢(shì)

圖6　材料表面種植細(xì)胞后第4和8天掃描電鏡結(jié)果

附表　各組細(xì)胞第1、3和5天光密度值比較 （）

附表　各組細(xì)胞第1、3和5天光密度值比較 （）

圖7　術(shù)后4和8周骨切片H E染色結(jié)果 （×100）

病理切片H E染色顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料周圍組織及交界部位生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，材料外層已經(jīng)開始降解；實(shí)驗(yàn)組有較多的新生骨質(zhì)（見圖7）。C D31免疫組織化學(xué)法染色顯示，實(shí)驗(yàn)組材料中有較多新生的毛細(xì)血管（見圖8）。

圖8　術(shù)后4和8周CD31免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果 （×100）

3　討論

由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因造成的各種類型骨缺損是臨床上遇到的常見問題。目前自體骨移植仍然是治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)［8］。但自體骨存在供骨量少，不能滿足大面積植骨的需求，且供區(qū)易出現(xiàn)損傷、感染、疼痛等并發(fā)癥［9］。因此，研制出理想的人工骨修復(fù)材料已成為臨床醫(yī)學(xué)和生物材料學(xué)努力探索的一項(xiàng)熱門課題。單一成分的組織工程骨修復(fù)小段骨缺損時(shí)，其早期成骨及后期骨愈合效果良好，但在用于修復(fù)大段骨缺損時(shí)，其材料內(nèi)部往往容易出現(xiàn)缺血性壞死，導(dǎo)致修復(fù)失敗，其主要原因就在于沒有很好地解決組織工程骨的血管化問題，血管化問題現(xiàn)已成為制約組織工程骨應(yīng)用于臨床的瓶頸［10］。

E PC s是一群尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，具有游走性，能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管形成，并能在出生后的血管新生過程中促進(jìn)血管生成［11-12］。這一發(fā)現(xiàn)也為解決組織工程骨血管化問題提供新的思路［13］。但是由于E PC s的細(xì)胞數(shù)量少，獲取難度大，體外培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)時(shí)需要擴(kuò)增等缺點(diǎn)，限制其在臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因的組織工程技術(shù)為血管化提供新的思路和方法。S H E等［14］報(bào)道，應(yīng)用V E G F-165基因轉(zhuǎn)染的E PC s能明顯促進(jìn)缺血心肌中血管新生，從而明顯改善大鼠急性心肌梗死后的心功能。S H EN等［15］研究表明，單純應(yīng)用V E G F或A N G-1基因轉(zhuǎn)染，僅能使腦缺血體積分別減少36% 和33%，假如兩者協(xié)同轉(zhuǎn)染，可使腦缺血體積減少44%。因此，學(xué)者們可以通過將V E G F-165與A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染E PC s，彌補(bǔ)其數(shù)量不足的缺點(diǎn)，增強(qiáng)E PC s的新生血管特性，能大大優(yōu)化E PC s的促血管新生效果。

目前，生物活性玻璃支架材料的研究與應(yīng)用已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)材料學(xué)科的研究熱點(diǎn)［16］。Z HOU［17］和S A NT O CI L DE S-R O M E R O等［18］實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，生物活性玻璃能夠在早期誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化，說(shuō)明其具有一定的骨誘導(dǎo)性，但其血管化能力差限制其在節(jié)段性骨缺損中的應(yīng)用［1］。因此，筆者將轉(zhuǎn)染雙基因的E PC s種植于多孔生物活性玻璃內(nèi)，以期構(gòu)建兼具骨誘導(dǎo)及血管生成誘導(dǎo)活性的組織工程骨材料，并對(duì)其生物相容性進(jìn)行研究。

組織工程骨作為一種植入人體的醫(yī)用材料，必須具有良好的生物相容性和生物安全性［19］。根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部門的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于長(zhǎng)期植入人體的材料必須進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平兩方面，觀察復(fù)合組織工程骨的生物相容性。從細(xì)胞水平來(lái)看，M TT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、掃描電鏡的結(jié)果表明，所制備的材料對(duì)轉(zhuǎn)染的E PC s無(wú)毒性，細(xì)胞在材料表面增殖明顯。從動(dòng)物水平來(lái)看，病理切片H E染色及C D31免疫組織化學(xué)法染色可見組織工程骨周圍與其交界處有較多的新生骨質(zhì)，植入的材料周圍組織生長(zhǎng)良好，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)材料中已長(zhǎng)入較多的新生毛細(xì)血管，表明復(fù)合材料的生物相容性良好，具備一定的誘導(dǎo)血管生成活性和促進(jìn)骨缺損修復(fù)的作用。

綜上所述，V E G F-165/A N G-1雙基因共轉(zhuǎn)染E PC s復(fù)合多孔生物活性玻璃人工骨材料具有良好的生物相容性，并具備一定促進(jìn)血管生成和骨缺損修復(fù)的作用。但是，該復(fù)合材料在修復(fù)節(jié)段性骨缺損的作用如何，材料的具體降解速率及新生血管的定量分析都將有待下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用檢驗(yàn)。

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（童穎丹 編輯）

Biocom patibility of porous bioactive glass-ceram ic loaded w ith VEGF165 and ANG1 gene cotransfected EPCs*

Yong-zeng Feng，Cheng-gui Wang，Xiao-long Shui，Yang Yu，Le-yi Cai，Hua-zi Xu
（Department of Orthopaedics，the Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou，Zhejiang 325000，China）

Objective To prepare a novel bone tissue engineering material with angiogenesis activity，and evaluate the biocompatibility and safety of the composites.M ethods Endothelial progenitor cells（EPCs）were cotransfected with VEGF165 and ANG1 genes and loaded into porous bioactive glass-ceramic to make the composite.The expressions of VEGF165 and ANG1 in EPCs were detected by RT-PCR and Western blot. MTT cytotoxicity test，bone implantation test and electron microscopic examination were used to comprehensively evaluate the biocompatibility of the composite.Immunohistochemical staining of CD31 was used to analyze revascularization of the composite zones.Results Both RT-PCR and Western blot showed cotransfected EPCs expressed increased VEGF165 and ANG1.The results of MTT cytotoxicity test and bone implantation test showed that the material was non-toxic.Scanning electron microscope displayed many EPCs adhered to the surface of the material，and had a lot of pseudopods.HE staining revealed tissue surrounding the material grew well without marked inflammatory cell infiltration.CD31 immunohistochemical staining indicated newly-formed capillaries into the material，demonstrating that the new tissue engineering material has good biocompatibility.Conclusions The composite of porous bioactive glass-ceramic loaded with VEGF165 and ANG1 gene cotransfected EPCs has good biocompatibility，and can improve angiogenesis.

VEGF165；ANG1；bioactive glass-ceramic；bone tissue engineering material；biocompatibility；angiogenesis

R318.08

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.008

1005-8982（2016）15-0044-06

2015-12-28

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：2016KY A138）；浙江省溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：Y20140569）