王志紅，黃漢，張斌，馬競(jìng)，張佳

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 錦州 121001）

論著

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)口愈合及W n t信號(hào)通路在愈合過程中的作用

王志紅1，黃漢2，張斌2，馬競(jìng)2，張佳1

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 錦州 121001）

目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（B M S C s）對(duì)皮膚創(chuàng)口愈合及W n t信號(hào)通路在愈合過程中的作用。方法原代培養(yǎng)S p r a g u e D aw l y大鼠B M S C s并C D29、C D44、C D90、C D45細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定；構(gòu)建SD大鼠皮膚創(chuàng)口損傷模型；實(shí)驗(yàn)分組：磷酸緩沖鹽溶液（P B S）對(duì)照組、B M S C s組，分別將P B S、B M S C細(xì)胞皮下注射到創(chuàng)口周圍，觀察創(chuàng)口愈合情況，計(jì)算創(chuàng)口愈合率；蛋白免疫印跡法檢測(cè)W n t1和β-c a t e nin基因表達(dá)水平。結(jié)果第3代B M S C s形態(tài)多為梭形、多突形。B M S C s可均一表達(dá)C D29、C D44、C D90，其陽性率分別為87.29%、91.66%和76.18%；而C D45呈陰性，其陽性率為3.14%。B M S C s可顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)口愈合；B M S C s組大鼠創(chuàng)面愈合率均高于P B S組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛋白免疫印跡結(jié)果B M S C s促進(jìn)W n t1和β-c a t e nin基因蛋白表達(dá)。結(jié)論B M S C s能促進(jìn)創(chuàng)口愈合，其促進(jìn)作用可能與W n t信號(hào)通路有關(guān)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；傷口愈合；信號(hào)通路

口腔頜面部外傷、腫瘤等?？稍斐纱竺娣e創(chuàng)傷缺損、瘢痕，嚴(yán)重者可致面部外形改變，由于位置特殊，常給患者造成巨大心理壓力。常規(guī)的皮膚、組織瓣等移植治療有許多條件限制，難以滿足目前臨床需要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marro w mesenchymal stem cells，B M S C s）屬于多潛能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下可分化成多種組織細(xì)胞，能夠作為理想的種子細(xì)胞用于組織器官損傷修復(fù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)所用S pra g u e Da w ly大鼠（以下簡(jiǎn)稱S D大鼠）雄鼠由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。達(dá)爾伯克必需基本（d u lbecco's minim u m essential medi u m，D M E M）低糖培養(yǎng)基購自美國H yclone公司，胎牛血清購自美國H yclone公司，W nt1、β-鏈蛋白（β-catenin）抗體購自上海萬類生物公司。

1.2SD大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)

選取同一時(shí)期繁殖的4只200 g左右S D雄鼠，10%水合氯醛按0.3ml/100 g腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡消毒，超凈臺(tái)內(nèi)取雙側(cè)股骨，分離去除骨表面附著組織。剪開一側(cè)骨骺，暴露髓腔，用含20%胎牛血清的D M E M完全培養(yǎng)基自另一側(cè)骺端反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗液收集到10 cm培養(yǎng)皿中，吹打混勻，置于37℃、5%二氧化碳C O2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 d后首次更換培養(yǎng)基，每48 h更換培養(yǎng)基，直至細(xì)胞融合至90%，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3接種于新的培養(yǎng)皿，2～3 d更換培養(yǎng)基，選擇形態(tài)均一、生長狀態(tài)良好的繼續(xù)傳代，第3～5代培養(yǎng)的B M S C s用作實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞。

1.3細(xì)胞鑒定

取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加磷酸緩沖鹽溶液（phosphate b uff er saline，P B S）吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×106/ml，加入到已標(biāo)記抗體（C D29、C D44、C D90、C D45）的流式管中，37℃孵育30min，離心收集細(xì)胞，留沉淀，P B S漂洗3次，P B S重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分離含B M S C s陽性表面標(biāo)志物的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4皮膚創(chuàng)口損傷模型制備及處理

S D雄鼠20只，隨機(jī)分成兩組。經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，背部剃毛，用無菌眼科剪在一側(cè)背部做直徑2 cm左右的全層皮膚損傷模型，將P B S、分離純化后的B M S C s分別皮下注射到兩組大鼠創(chuàng)口周圍，模型制備當(dāng)天記為第1天，分別于1、7和14d觀察創(chuàng)口愈合情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）=（開始創(chuàng)傷面積-未愈合創(chuàng)面面積）/開始創(chuàng)傷面積。

1.5蛋白免疫印跡法

14 d麻醉處死實(shí)驗(yàn)大鼠，沿創(chuàng)口周圍2mm處剪下創(chuàng)口皮膚全層，取下的組織經(jīng)研磨、裂解，提取蛋白樣品。蛋白濃度測(cè)定后，樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。一抗4℃過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris b uff ered saline and t w een 20，T B S T）洗3次，二抗室溫1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

B M S C s細(xì)胞形態(tài)多為梭形、多突形，其中混雜圓形的造血細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d細(xì)胞融合可＞90%；傳代細(xì)胞24 h內(nèi)基本貼壁，之后細(xì)胞單克隆復(fù)制多呈束狀或漩渦狀排列。見圖1。

2.2BMSCs表面標(biāo)記物鑒定流式細(xì)胞儀的檢測(cè)

第 3代大鼠的 B M S C s可均一表達(dá) C D29、C D44、C D90，其陽性率分別為87.29%、91.66%和76.18%；而C D45呈陰性，其陽性率為3.14%。

2.3大鼠創(chuàng)口愈合過程

圖1　第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （×100）

3組實(shí)驗(yàn)大鼠7和14 d時(shí)創(chuàng)口愈合情況比較，B M S C s組大鼠創(chuàng)口愈合明顯較P B S組快，B M S C s可顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)口愈合（見圖2）。B M S C s組7和14 d大鼠創(chuàng)面愈合率分別為（86.464±1.278）%和（90.062±0.172）%均明顯高于P B S組的（41.972± 1.621）%和（61.664±2.477）%，經(jīng)用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（見圖3）。

2.4蛋白免疫印跡法檢測(cè)

B M S C s組W nt1和β-catenin基因蛋白表達(dá)水平高于P B S組。見圖4。

圖2　大鼠創(chuàng)口愈合過程

圖3　大鼠創(chuàng)口愈合率

圖4　免疫印跡法檢測(cè)W n t1和β-c ate n i n蛋白表達(dá)水平

3　討論

皮膚創(chuàng)口愈合是一個(gè)涉及多種細(xì)胞、多種因子的修復(fù)、重建過程［1］，是各種組織再生和肉芽組織增生、瘢痕組織形成的復(fù)雜組合，表現(xiàn)出各種過程的協(xié)同作用。大致包括炎癥、增殖和重塑階段［2］。長期的皮膚創(chuàng)口愈合不良對(duì)患者生活、工作具有重大影響，是臨床研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合機(jī)制的研究也逐漸深入。

B M S C s屬于多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)。在特定誘導(dǎo)條件下，體內(nèi)或是體外培養(yǎng)的B M S C s可分化為骨、軟骨、內(nèi)皮、心肌等多種組織細(xì)胞，能夠用于衰老病變組織器官的損傷修復(fù)。B M S C s在骨髓中的含量很少，約占有核細(xì)胞的0.001%～0.100%［3］，原代培養(yǎng)B M S C s通過換液去除大量未貼壁的造血細(xì)胞，呈圓形或類圓形的貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)后形態(tài)多為梭形、多突形。本研究中，原代培養(yǎng)的B M S C s可大量擴(kuò)增并傳代，且經(jīng)鑒定第3代大鼠的B M S C s可均一表達(dá)C D29、C D44、C D90，其陽性率分別為87.29%、91.66% 和76.18%；而C D45呈陰性，其陽性率為3.14%。

B M S C s可顯著促進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠創(chuàng)口愈合，且創(chuàng)面愈合率明顯高于對(duì)照組。B M S C s促進(jìn)創(chuàng)口愈合的具體機(jī)制目前仍不完全清楚。其可能機(jī)制有：①B M S C s的自我更新能力和多向分化能力可長期保持，其可在創(chuàng)面局部增生并分化為創(chuàng)面修復(fù)所需的細(xì)胞，如角質(zhì)形成細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、汗腺細(xì)胞等［4-5］。②促進(jìn)皮膚網(wǎng)狀嵴樣結(jié)構(gòu)形成。③B M S C s的旁分泌作用。許多研究表明，B M S C s可分泌大量促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生長因子［6］。④免疫調(diào)理作用。⑤B M S C s可能還有促進(jìn)體內(nèi)干細(xì)胞遷移到傷口局部、減輕纖維化、保持細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境平衡及減少細(xì)胞凋亡等作用［7］。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，W nt蛋白家族參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)過程［8］，并參與維持干細(xì)胞的多潛能性等。W nt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，由W nt蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白等組成。W nt信號(hào)通路主要有3條途徑：①經(jīng)典W nt/β-catenin通路，又稱為經(jīng)典W nt通路；②W nt/PCP通路，又稱平面細(xì)胞極性信號(hào)通路；③W nt/C a2+通路。其中，最被熟知的是經(jīng)典W nt/β-catenin通路，而W ntl是激活經(jīng)典W nt信號(hào)通路的主要W nt蛋白［9-10］。有研究證實(shí)，經(jīng)典W nt信號(hào)通路中的相關(guān)成員參與創(chuàng)面愈合［11］，其參過程可能與其具有調(diào)控皮膚及其附屬器的發(fā)育、誘導(dǎo)皮膚附件的形態(tài)發(fā)生、促進(jìn)創(chuàng)面血管新生及上皮重塑等多種功能有關(guān)。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明，B M S C s能促進(jìn)W nt1和β-catenin基因蛋白表達(dá)水平，激活經(jīng)典W nt/β-catenin，促進(jìn)創(chuàng)口愈合。

B M S C s能夠有效促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但B M S C s實(shí)際應(yīng)用到臨床仍有一些不足之處。自體和同種異體干細(xì)胞移植治療均已有致瘤報(bào)道，例如干細(xì)胞移植后致皮膚惡性腫瘤、胃癌、成骨肉瘤等［12］。并且B M S C s還可促進(jìn)宿主體內(nèi)原有腫瘤的生長［13］。另外，B M S C s體外移植后能否繼續(xù)保持未分化狀態(tài)、是否能起到長期的作用效果還需要進(jìn)一步探索。因此，B M S C s治療創(chuàng)口愈合的臨床應(yīng)用還有待進(jìn)一步評(píng)估。

［1］L EE S H，Z A HOO R M，HW A N G JK，et al.V alproic acid ind u ces c u taneo u s w o u ndhealin ginv i v oandenhances k eratinocyte motility［J］.P L o S O ne，2012，7（11）:D O I:10.1371/j o u rnal.pone.0048791.

［2］M END O C AR J，C OU T I N HO-NETT OJ.C ell u lar aspects o f w o u nd healin g［J］.A n B ras Dermatol，2009，84（3）:257-262.

［3］祝旭龍，顏?zhàn)T，姚維杰，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法優(yōu)化［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（11）:1621-1626.

［4］M A K，L I A O S，H E L，et al.E ff ects o f nano f iber/stem cell composite on w o u nd healin g in ac u te fu ll-thic k ness s k in w o u nds［J］. Tiss u e En g P art A，2011，17（9/10）:1413-1424.

［5］WU Y，C H EN L，S C O TT P G，et al.M esenchymal stem cells enhance w o u nd healin g thro u g h di ff erentiation and an g io g enesis［J］. S tem C ells，2007，25（10）:2648-2659.

［6］HO C K I N G A M，GI B R A N N S.M esenchymal stem cells:paracrine si g nalin g anddi ff erentiationd u rin g c u taneo u s w o u nd repair［J］. E x p C ell R es，2010，316（14）:2213-2219.

［7］B A R A N I A K P R，MC DE V I TT D C.S tem cell paracrine actions and tiss u e re g eneration［J］.R e g en M ed，2010，5（1）:121-143.

［8］IG O T A S，T O S A M，M U R A K A MI M，et al.I denti f ication and characteri z ation o f W nt si g nalin g path w ay in k eloid patho g enesis［J］. I nt J M ed S ci，2013，10（4）:344-354.

［9］H L UB E K F，B R A B L ET Z T，BU D C Z I E S J，et al.H etero g eneo u s e x pression o f W nt/beta-catenin tar g et g enes w ithincolorectal cancer［J］.I nt J C ancer，2007，121（9）:1941-1948.

［10］M A N O L A G A S S C，A L M E I D A M.G one w ith the W nts:betaeatenin，T-cell f actor，f or k head bo x O，and o x idati v e stress in a g e-dependent diseases o f bone，lipid，and g l u cose metabolism［J］. M olEndoerinol，2007，21（11）:2605-2615.

［11］K A T OH M，K A T OH M.W NT si g nalin g path w ay and stem cell si g nalin g net w or k［J］.C lin C ancer R es，2007，13（14）:4042-4045.

［12］H E R B E R T S C A，KW A M S，H E R M S EN H P.R is k f actors in the de v elopment o f stem cell therapy［J］.J Transl M ed，2011，9: 29.

［13］L A Z ENNE C G，JO R G EN S EN C.C oncise re v ie w:ad u lt m u ltipotent stromal cells and cancer:ris k or bene f it［J］.S temC ells，2008，26（6）:1387-1394.

（童穎丹 編輯）

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on skin wound healing and role of W nt signaling pathway in healing process

Zhi-hong Wang1，Han Huang2，Bin Zhang2，Jing Ma2，Jia Zhang1
（1.Graduate School of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China；2.Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China）

Objective To study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on skin wound healing and the role of Wnt signaling pathway in the healing process.M ethods Primary cultured BMSCs were from SD rats.CD29，CD44，CD90 and CD45 cell surface markers were identified.SD rat skin wound healing model was constructed.Experimental groups included PBS control group and BMSCs group，in which the PBS and BMSCs were injected subcutaneously around the wound respectively.Wound healing was observed and the rate of wound healing was calculated.Using Western blot Wnt1 andβ-catenin expression levels were detected. Results The third-generation BMSCs were fusiform and multi-shaped with protrusions.BMSCs could uniform ly express CD29，CD44 and CD90，the positive rates were 87.29%，91.66%and 76.18%respectively；the positive rate of CD45 was only 3.14%.BMSCs could significantly promote wound healing in the rats.The wound healing rate of the BMSCs group was significantly higher than that of the PBS group，and the BMSCs promoted Wnt1 andβ-catenin protein expressions.Conclusions BMSCs can promote wound healing，which may be related to the promotion of the role of Wnt signaling pathway.

bone marrow mesenchymal stem cell；wound healing；signal pathway

R 683

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.010

1005-8982（2016）15-0056-04

2015-12-18

黃漢，E-mail：k q2015525@163.com；Tel：0416-4197262