彭燕，莫吉祥，王新

（1.湘潭職業(yè)技術(shù)學院 婦產(chǎn)科教研室，湖南 湘潭 411100；2.中南大學湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410011）

論著

M i c roRN A-126和血管內(nèi)皮生長因子在胚胎停育絨毛組織中的表達及相關(guān)性研究*

彭燕1，莫吉祥1，王新2

（1.湘潭職業(yè)技術(shù)學院 婦產(chǎn)科教研室，湖南 湘潭 411100；2.中南大學湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410011）

目的通過分析孕早期胚胎停育與正常胚胎絨毛組織中m i c ro R NA-126（m i R-126）、血管內(nèi)皮生長因子（V E G F）的表達差異，探討其在早期胚胎停育中的相關(guān)性。方法收集孕早期胚胎停育和正常胚胎絨毛組織各28例作為胚胎停育組和對照組，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（R T-P C R）檢測兩組m i R-126和V E G F mR NA表達水平的變化。結(jié)果①兩組絨毛組織中均有m i R-126表達，胚胎停育組絨毛組織中m i R-126的表達高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。②胚胎停育組絨毛組織中V E G F的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。③胚胎停育組絨毛組織中m i R-126與V E G F的表達呈負相關(guān)；對照組絨毛組織中m i R-126與V E G F的表達呈正相關(guān)。結(jié)論①胚胎停育絨毛組織中V E G F的表達低于正常胚胎。②V E G F的表達變化與胚胎停育的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

胚胎停育；絨毛組織；m i c ro R NA-126；血管內(nèi)皮生長因子

胚胎停止發(fā)育是指妊娠早期因某種原因引起胚胎發(fā)育停止、胚胎死亡，最終結(jié)局常表現(xiàn)為稽留流產(chǎn)和不全流產(chǎn)。近年來，胚胎停育發(fā)病率有逐年增加的趨勢。有學者認為，胎盤形成過程中血管功能不全可能是導致胚胎停育的眾多原因之一［1］。

M icro R N A（mi R）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類進化上非常保守、穩(wěn)定性好的內(nèi)源性非編碼小分子R N A，已成為生物學一個研究的熱點。mi R-126在血管內(nèi)皮細胞中特異性表達，具有促進胚胎新生血管形成并維持管壁完整性的作用［2-3］。有資料表明，mi R-126過表達能明顯增加內(nèi)皮先祖細胞的集落形成、增殖，減少細胞凋亡［4］。血管內(nèi)皮生長因子（v asc u lar endothelial g ro w th f actor，V E G F）是目前所知道的作用最強的促血管生成因子，在血管內(nèi)皮細胞中特異性表達［5］。

mi R-126和V E G F作為兩種對內(nèi)皮細胞起作用的因子，在妊娠過程中的重要性是顯而易見的。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，V E G F是mi R-126的預測靶基因之一。但目前國內(nèi)外在mi R-126對V E G F的相關(guān)性方面研究較少，并且主要集中在腫瘤方面的研究，而在胚胎停育方面的研究未見報道。本課題采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（re v erse transcriptionpolymerase chain reaction，R T-PC R）法分析胚胎停育絨毛組織中mi R-126、V E G F m R N A的表達，進而探討兩者與胚胎停育發(fā)病的相關(guān)性，為進一步研究其發(fā)病機制提供新思路。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取2012年11月1日-2013年1月31日在中南大學湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的胚胎停育和正常妊娠要求人工流產(chǎn)患者的絨毛組織各28例。其中，年齡19～33歲；孕周7～10周，均為漢族。納入標準：初孕婦，既往月經(jīng)規(guī)則，停經(jīng)49～70 d，近3月未服用激素類藥物，妊娠期間無明顯感染病史，血常規(guī)、凝血功能正常，白帶常規(guī)無明顯異常。排除標準：無生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌異常，詢問無糖尿病、心血管疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺功能異常等其他全身性疾病病史，否認家族遺傳性疾病，近期無用藥、手術(shù)創(chuàng)傷史，無不良的生活習慣。參照G UO等［6］的診斷依據(jù)，收集胚胎停育患者絨毛組織標本28例作為胚胎停育組；同時收集早期正常妊娠自愿要求行人工流產(chǎn)手術(shù)患者絨毛組織標本28例作為對照組。

1.2實驗方法

1.2.1絨毛組織總R NA提取和質(zhì)量檢測將兩組絨毛組織各100m g勻漿研磨，Tri z ol一步法提取組織總R N A。每組各取樣品用紫外分光光度計測定其在260和280 nm波長的光密度值（optical density，O D）。經(jīng)電泳觀察條帶。

1.2.2引物的設(shè)計mi R-126及內(nèi)參U6引物購自廣州復能公司（H mi R Q0098）（見表1）。V E G F及內(nèi)參β-actin從美國國立生物技術(shù)信息中心下載，引物設(shè)計采用P rimer 5.0軟件（見表2）。

表1　m i R-126及內(nèi)參U6的引物序列

表2　V EGF和內(nèi)參β-a c t i n的引物序列

1.2.3c DNA的合成采用美國F ermentans公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDN A的合成。

1.2.4R T-P C R檢測采用日本Toyobo公司的S YB R G reen q PC R M i x試劑盒，按說明書操作步驟進行PC R擴增，反應體系總體積為20μl。

1.32-ΔΔCt法分析實驗結(jié)果

本研究的R T-PC R數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析，用內(nèi)參U6/β-actin對目的基因的表達量進行歸一化處理。

1.4統(tǒng)計學方法

采用S P SS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布的計量資料經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后再行統(tǒng)計分析；兩組間的比較行t檢驗，數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析用P earson相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1　總RN A瓊脂糖凝膠電泳圖

2　結(jié)果

2.1總RN A結(jié)果

兩組絨毛組織中總R N A呈乳白色半透明狀，經(jīng)1%變性瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察，可見3條明顯電泳條帶：r R N A 28S，r R N A 18S，r R N A 5 S（見圖1）。r R N A 28 S和r R N A 18S兩條帶明顯、清晰、無任何拖尾條帶出現(xiàn)，并且28 S條帶的亮度明顯亮于18S條帶，紫外光分光光度儀測定其O D260/O D280比值為1.8～2.0，提示本實驗所提取的R N A純度高、完整性好，可以滿足R T-PC R實驗的需要。

2.2兩組絨毛組織中m i RN A-126的表達

mi R-126在兩組絨毛組織中均有表達，且兩組mi R-126表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.571）。見表3。

2.3兩組絨毛組織中V EGF的表達

V E G F在兩組絨毛組織中均有表達。胚胎停育組V E G F的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t= 13.874，P=0.000）。見表4。

2.4胚胎停育組絨毛組織中m i R-126、V EGF表達的相關(guān)性分析

P earson直線相關(guān)分析結(jié)果表明，胚胎停育組絨毛組織中mi R-126與V E G F的表達呈負相關(guān)，對照組絨毛組織中mi R-126與V E G F的表達呈正相關(guān)。

見圖2、3。

表3　兩組絨毛組織中m i R-126的表達比較

表4　兩組絨毛組織中V EGF的表達比較

圖2　胚胎停育組m i R-126、V EGF表達的相關(guān)性

圖3　對照組m i R-126、V EGF表達的相關(guān)性

3　討論

3.1m i R-126與胚胎停育的相關(guān)性

胚胎/胎兒的生長發(fā)育與滋養(yǎng)細胞的有效侵入及胎盤絨毛血管發(fā)育關(guān)系密切，而胎盤絨毛血管的形成過程實際上就是血管內(nèi)皮細胞的生長發(fā)育過程。mi R-126基因組定位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7（epidermal g ro w th f actor-li k edomain 7，E G F L7）基因的第7個內(nèi)含子中，而E G F L7本身就是血管內(nèi)皮特異性表達的基因，因而兩者共同作用對血管的形成、發(fā)育及功能起調(diào)控作用［7］。S E H MI DT等［8］研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠的E G F L7基因敲除后，部分胚胎死于血管發(fā)育缺陷及異常的胚胎干細胞聚集，提示在實驗中可能不僅敲除E G F L7基因，還敲除編碼mi R-126的基因［9］。本實驗用R T-PC R檢測胚胎停育組和對照組絨毛組織中mi R-126的表達水平。結(jié)果表明mi R-126在兩組中均有表達，胚胎停育組的相對表達量是對照組的1.16倍，但差異無統(tǒng)計學意義?？赡艿脑驗椋孩傺苄律赡苁芏喾Nmi R的共同調(diào)控。②mi R-126在早期胚胎發(fā)育過程中可能并未直接參與調(diào)節(jié)絨毛血管的形成。③本次實驗樣本量較少，可能對實驗造成一定的局限性。

3.2V EGF與胚胎停育的相關(guān)性

V E G F又稱血管調(diào)理素或血管通透因子，是至今為止發(fā)現(xiàn)的最有力的血管生成因子，在妊娠中發(fā)揮重要作用［10］。近年來研究表明，V E G F功能及表達異?？梢鹋咛ブ踩爰疤ケP血管網(wǎng)形成障礙，提示V E G F是造成自然流產(chǎn)的重要原因之一［11］。本實驗應用R T-PC R檢測胚胎兩組絨毛組織中V E G F m R N A的相對表達水平。結(jié)果顯示，胎停育組絨毛組織中V E G F的表達明顯低于對照組，這提示胚胎停育發(fā)病機制之一是絨毛組織內(nèi)V E G F表達水平下降，結(jié)合V E G F生理作用及其在妊娠中的調(diào)節(jié)作用，推測其可能原因為：①V E G F表達下降，可減弱內(nèi)皮細胞遷移、增殖功能，導致蛻膜血管、絨毛血管等生成減少，造成絨毛內(nèi)血流量減少，影響到胚胎的正常發(fā)育，最終導致胚胎停育；②V E G F表達下降，導致絨毛組織植入子宮內(nèi)膜過淺，形成絨毛滋養(yǎng)細胞淺著床，導致流產(chǎn)或母胎間營養(yǎng)交換障礙，胚胎停止發(fā)育；③V E G F表達下降，能下調(diào)與血管通透性相關(guān)的活性物質(zhì)的表達，影響母胎間的營養(yǎng)交換，導致胚胎生長發(fā)育受阻，甚至胚胎停育。

3.3m i R-126、V EGF在胚胎停育中的相關(guān)性

通過生物信息學技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，E G F、S pred1是 mi R-126眾多預測靶基因中的2個基因［12］。mi R-126在早期胚胎發(fā)育方面是否存在對V E G F的調(diào)節(jié)，尚不清楚。F I S H等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠靜脈內(nèi)皮細胞生長發(fā)育方面，mi R-126可通過抑制 S pred1和PI K3R2 m R N A水平表達，提高內(nèi)皮細胞對V E G F和堿性成纖維因子（basic f ibroblast g ro w th f actor，b F G F）的敏感性，參與胚胎新生血管形成，并維持血管的完整性。由此可以看出，mi R-126與V E G F呈正相關(guān)。但是L I U等［14］研究mi R-126在肺癌中的表達發(fā)現(xiàn)，上調(diào)mi R-126可以明顯抑制V E G F的表達，對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起抑制作用。從L I U的研究中可以看出，mi R-126與V E G F呈負相關(guān)。本實驗為進一步探討mi R-126和V E G F在胚胎發(fā)育方面的相關(guān)性，對兩組絨毛組織中mi R-126與V E G F的表達進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者在胚胎停育組中呈負相關(guān)，提示mi R-126與V E G F在胚胎停育的發(fā)生、發(fā)展中有負向調(diào)節(jié)作用。這與L I U［14］和張昱等［15］的實驗結(jié)果基本一致。而兩者在對照組中卻呈正相關(guān)，提示mi R-126與V E G F在胚胎正常的發(fā)育過程中有正向調(diào)節(jié)作用。這與F I S H等［13］的實驗結(jié)果一致。因此筆者推測，同一種mi R N A在不同的生理、病理過程中，可以通過調(diào)控不同的靶基因而發(fā)揮不同的作用。mi R-126在正常妊娠時可通過抑制S pred1基因，提高內(nèi)皮細胞對V E G F和b F G F的敏感性，參與胚胎血管的新生并維持血管的完整性。而在胚胎停育時，mi R-126則可能通過直接抑制V E G F基因的表達，從而使胚胎血管發(fā)育減少或功能異常。

胚胎停育發(fā)病因素復雜，發(fā)病機制尚未明確，相信隨著胚胎停育方面mi R研究的逐漸深入，有望通過干擾mi R-126的調(diào)控作用而減少胚胎停育的發(fā)生，并且為臨床早期監(jiān)測胚胎發(fā)育及治療胚胎停育提供新的靶點。

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（申海菊 編輯）

Expressions of m icroRNA-126 and VEGF in chorionic villi of grow th-arrest early embryo and their correlation*

Yan Peng1，Ji-xiang Mo1，Xin Wang2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Xiangtan Vocational and Technical College，Xiangtan，Hunan 411100，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410011，China）

Objective To investigate the expressions of microRNA-126（miR-126）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in the chorionic villi of growth-arrest early embryo group and the chorionic villus of normal control group，and analyze the different expressions of miR-126 and VEGF between them so as to explore their relationship in early embryo growth arrest.Methods The chorionic villi of 28 cases in early embryo growth arrest group and 28 cases in control group were collected.Using reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR），the expression levels of miR-126 and VEGF mRNA in the two groups were detected.Results miR-126 was expressed in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group and the control group.The expression of miR-126 in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group was higher than that of the control group，but the difference was not significant.The expression of VEGF in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group was significantly lower than that of the control group，the difference was statistically significant.Anegative correlation was found between miR-126 and VEGF in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group，while a positive correlation was found between miR-126 and VEGF in the chorionic villi of the control group.Conclusions The expression of VEGFin the chorionic villi of growth-arrest early embryo is lower than that in normal chorionic villi.There is a certain correlation between the change of VEGF expression and the early embryo growth arrest.

early embryo growth arrest；chorionic villus；miR-126；vascular endothelial growth factor

R 715.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.014

1005-8982（2016）15-0076-05

2015-11-24

湖南省教育廳科學研究項目（No：14C1111）