張津銘　呂正濤　盧偉偉　李興艷　董永輝　祁軍　黃暉　郭風(fēng)勁　陳安民

·骨科護理·

基質(zhì)細胞衍生因子-1對小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬水平的影響

張津銘呂正濤盧偉偉李興艷董永輝祁軍黃暉郭風(fēng)勁陳安民

目的通過研究基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal derived factor-1，SDF-1）對小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬的影響，探討SDF-1在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用及機制。方法分離并體外培養(yǎng)小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞，分別予以0、1、10、100、1 000 μg/L濃度的五組重組SDF-1蛋白干預(yù)24 h。運用RT-PCR檢測各組細胞的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）和UNC-51樣激酶復(fù)合物1 （uncoordinated-51 like kinase 1，ULK1）mRNA表達情況，運用Western Blot方法檢測LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ULK1及泛素連接蛋白62（ubiquitin-binding protein p62，p62）蛋白表達水平，通過透射電鏡觀察自噬溶酶體。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示10、100、1 000 μg/L濃度條件下LC3、ULK1的mRNA水平明顯高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot結(jié)果顯示1、10、100、1 000 μg/L的各組細胞的LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值、ULK-1表達水平較對照組升高，p62蛋白表達水平較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。透射電鏡結(jié)果顯示經(jīng)SDF-1干預(yù)后，自噬溶酶體較對照組增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論SDF-1可誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬的發(fā)生，SDF-1可能通過調(diào)節(jié)軟骨細胞自噬水平參與了骨性關(guān)節(jié)炎的進展。

基質(zhì)細胞衍生因子-1；軟骨細胞；自噬；骨關(guān)節(jié)炎

基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal derived factor-1，SDF-1）又稱為CXC趨化因子配體-12［chemokine（C -X-C motif）ligand 12，CXCL12］，是屬于CXC趨化因子亞家族，其受體為CXC趨化因子受體4［chemokine（C-X-C）receptor 4，CXCR4］和趨化因子受體CXC趨化因子受體7［chemokine（C-X-C）receptor 7，CXCR7］，具有調(diào)控細胞動員、遷移等作用［1］。

目前認為SDF-1/CXCR4軸在骨性關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中也起著重要作用［2］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中SDF-1濃度較正常人增高，并且其濃度與骨性關(guān)節(jié)炎程度呈正相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)SDF-1導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生可能通過其促進軟骨細胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）等導(dǎo)致軟骨損傷［3］。自噬是真核生物中高度保守的生理過程，缺氧、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏及其他細胞應(yīng)激均能導(dǎo)致自噬水平的升高以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞在惡劣條件下存活［4］，自噬在骨性關(guān)節(jié)炎中起重要作用［5］。

本研究擬通過研究不同濃度的SDF-1對小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬水平的影響，探討SDF-1在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制。以期為進一步揭示骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制及其藥物治療等提供實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要試劑及材料

胎牛血清（Gibco公司，美國）；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基與F12營養(yǎng)素1∶1培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Media∶Nutrient Mixture F-12，DMEM/F12，Hyclone公司，美國）。Rever Tra Ace-α-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（Toyobo公司，日本）。LC3抗體、ULK-1抗體、p62抗體（CST公司，美國）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、蛋白定量檢測試劑盒、凝膠試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（武漢博士德公司，中國）。重組小鼠SDF-1α蛋白（PeproTech公司，美國）。LC3、ULK1、GAPDH引物由武漢擎科生物公司合成。

二、小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離及培養(yǎng)

采用3～4天齡的C57BL/6小鼠，雌雄不限，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，為清潔級實驗動物。常規(guī)處死小鼠后于無菌操作下游離膝關(guān)節(jié)，充分清理滑膜組織及半月板后以顯微剪分離關(guān)節(jié)軟骨組織，剪碎至1 mm3大小。依次用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，0.2%Ⅱ型膠原酶消化6～ 8 h。收集小鼠細胞并接種于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，置于恒溫37.0℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、細胞干預(yù)及分組

選取體外培養(yǎng)的第1～2代軟骨細胞按2×105個/孔接種于6孔板中，細胞生長至80%融合后更換為無血清培養(yǎng)基并進行藥物干預(yù)。行RT-PCR和Western Blot實驗時，將細胞分為五組，分別予以SDF-1重組蛋白0、1、10、100和1 000 μg/L，干預(yù)時間為24 h，并設(shè)立3個平行實驗。行透射電鏡檢測時將細胞分為0 μg/L和100 μg/L組，兩組分別予以SDF-1重組蛋白0、100 μg/L干預(yù)24 h，設(shè)立3個平行實驗。

四、RT-PCR檢測基因表達

抽提各組細胞總RNA，主要步驟如下:將實驗處理后的細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌3次，加入裂解液350 μl，充分裂解后收集懸液。12 000 g離心15 min，收集上清并靜置后加入200 μl三氯甲烷，靜置10 min后以12 000 g離心15 min。取上清液加入等體積異丙醇，充分混勻后離心去除上清液。經(jīng)75%乙醇洗滌后用無酶水重新溶解獲得總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機引物及逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。而后應(yīng)用RT-PCR儀對cDNA產(chǎn)物進行RT-PCR檢測。反應(yīng)體系為20 μl，其中含SYBR RT-PCR SuperMix 10 μl，無酶水為7.4 μl，上、下游引物（表1）各0.8 μl，模板cDNA 1 μl。預(yù)變性:95℃30s。變性:95℃15 s；退火: 60℃15 s；延伸:72℃30 s；共40個循環(huán)。

表1　各基因引物序列及產(chǎn)物長度

五、Western Blot檢測蛋白表達

干預(yù)后的細胞用預(yù)冷的PBS洗滌，每孔加入100 μl細胞裂解液制備蛋白樣本。測定蛋白濃度后每孔加入20 μg蛋白樣本并進行電泳，轉(zhuǎn)膜后使用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液室溫搖床上封閉1 h，加入按1∶1 000稀釋的一抗后于4℃孵育過夜，洗膜后加入按1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h。洗膜后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色并采集照片，用Image Lab 5.1軟件測量條帶灰度值并進行統(tǒng)計分析。

六、透射電鏡觀察自噬小體

干預(yù)后將軟骨細胞以0.25%胰酶消化脫壁，離心成細胞團并用2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液固定，洗滌后再次用1%鋨酸固定液固定。經(jīng)乙醇、丙酮梯度脫水后包埋、固化，制備超薄切片后以3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡觀察拍片。兩組細胞分別在電鏡下隨機挑選25個細胞，計數(shù)細胞內(nèi)自噬溶酶體的數(shù)量并進行統(tǒng)計分析。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組計量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析及t檢驗進行統(tǒng)計檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、SDF-1對關(guān)節(jié)軟骨細胞ULK1和LC3的mRNA表達的影響

樣本經(jīng)RT-PCR檢測后運用2-??Ct法進行計算分析，結(jié)果顯示SDF-1濃度為0、1、10、100、1 000 μg/L各組細胞的ULK1的mRNA相對表達水平分別為: 1.00±0.16、1.14±0.29、1.83±0.23、2.47±0.38和1.98± 0.31，其中10、100和1 000 μg/L組較對照組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1 a）。0、1、10、100和1 000 μg/L各組細胞的LC3的mRNA相對表達水平分別為:1.00±0.15、1.08±0.09、1.42±0.13、1.68±0.21和1.80±0.33，其中10、100和1 000 μg/L組的LC3 mRNA相對表達水平較對照組增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1 b）。但1 μg/L組的ULK1、LC3 mRNA相對表達水平較對照組，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

二、SDF-1對關(guān)節(jié)軟骨細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及ULK1、p62蛋白表達水平的影響

Western Blot結(jié)果示各組細胞均表達LC3、ULK1、p62蛋白（圖2 a）。關(guān)節(jié)軟骨細胞經(jīng)不同濃度SDF-1干預(yù)24h后，1、10、100和1000μg/L的各組細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2 b）。1、10、100和1 000 μg/L的各組的ULK-1蛋白表達水平較對照組升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2 c）。1、10、100和1 000 μg/L的各組的p62蛋白表達水平較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2 d）。

圖1　RT-PCR檢測ULK1及LC3的mRNA表達水平　a:經(jīng)不同濃度SDF-1干預(yù)的關(guān)節(jié)軟骨細胞ULK1 mRNA相對表達水平。1、10、100和1 000 μg/L組分別與0 μg/L組比較，P值分別為0.516、0.007、0.004、0.009；b:經(jīng)不同濃度SDF-1干預(yù)的關(guān)節(jié)軟骨細胞LC3 mRNA相對表達水平。1、10、100和1 000 μg/L組分別與0 μg/L組比較，P值分別為0.476、0.022、0.010、0.020

三、透射電鏡觀察SDF-1對關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬小體的影響

透射電鏡實驗中，0 μg/L組和100 μg/L組軟骨細胞經(jīng)透射電鏡檢查可見細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)（圖3 a、c）。圖3中白色箭頭所指示結(jié)構(gòu)即為自噬溶酶體，其內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)，部分內(nèi)容物已降解（圖3 b、d）?？梢娊?jīng)濃度為100 μg/L的SDF-1干預(yù)后，自噬溶酶體的數(shù)量較對照組增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3 e）。

討論

一、自噬的定義及過程

圖2　Western Blot檢測并計算LC3-Ⅱ/Ⅰ比值以及ULK1、p62蛋白表達水平　a:蛋白凝膠電泳圖；b:條帶灰度分析計算LC3-II/I比值。1、10、100和1 000 μg/L組分別與0 μg/L組比較，P值分別為0.027、0.004、0.001、0.002；c:條帶灰度分析計算ULK1相對表達量。1、10、100和1 000 μg/L組分別與0 μg/L組比較，P值分別為0.001、0.012、0.001、0.005；d:條帶灰度分析計算p62蛋白相對表達量。1、10、100和1 000 μg/L組分別與0 μg/L組比較，P值分別為0.001、0.007、0.009、0.005

圖3　透射電鏡觀察小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬溶酶體（白色箭頭）（3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色） a:對照組，1 700×；b:對照組，3 500×；c:SDF-1組，1 700×；d:SDF-1組，3 500×；e:透射電鏡下觀察兩組細胞中自噬溶酶體的數(shù)量。與對照組比較，*P＜0.001

自噬現(xiàn)象最早被發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，是真核生物在自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，Atg）的調(diào)控下通過溶酶體降解和回收細胞組分、營養(yǎng)物質(zhì)的高度保守的生物過程［6，7］。研究報道自噬在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育［8］、腫瘤［9］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?0］中均發(fā)揮重要作用。自噬發(fā)生初期會形成一個小的類似“脂質(zhì)體”樣的雙層膜結(jié)構(gòu)，通過擴張、延伸、封閉成為具有雙層膜結(jié)構(gòu)的球狀自噬小體，其內(nèi)常包裹細胞質(zhì)、降解蛋白、損傷細胞器等結(jié)構(gòu)，而后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，自噬體中的“貨物”也被降解，氨基酸、脂肪酸等產(chǎn)物可被回收供細胞重新利用，而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞質(zhì)中，該過程可通過透射電鏡觀察［7，11］。當(dāng)自噬發(fā)生時，ULK-1（即ATG1在哺乳動物中的同源物）承擔(dān)啟動作用，胞質(zhì)型LC3（即LC3-Ⅰ）蛋白與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成膜型LC3（即LC3-Ⅱ）定位于自噬體的膜上，參與自噬體膜的延伸過程，因此通過測定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值可以反映細胞自噬水平的變化［12］。自噬的底物p62通常在自噬增加時其降解增多，表達量減少，當(dāng)自噬被抑制時p62發(fā)生累積表達增高，相反自噬增加時其表達降低［13］。

二、SDF-1對細胞自噬水平的影響

SDF-1是一種趨化因子，具有誘導(dǎo)炎性細胞遷移、定植的作用。Kanbe等［14］在對骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液的研究中發(fā)現(xiàn)，其SDF-1濃度較正常人增高，并且其濃度與骨性關(guān)節(jié)炎程度呈正相關(guān)。Herberg等［15］的研究表明SDF-1β能通過提高骨髓間充質(zhì)干細胞自噬水平使其在過氧化氫誘導(dǎo)的細胞死亡中存活下來。Yang等［16］發(fā)現(xiàn)SDF-1α可以誘導(dǎo)牙髓干細胞發(fā)生自噬和遷移。王天寶等［17］通過敲減SDF-1的受體CXCR4的表達，抑制了人結(jié)腸癌細胞的自噬水平。本研究中給予不同濃度SDF-1干預(yù)小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)高濃度SDF-1干預(yù)后，LC3、ULK1 mRNA水平與ULK-1蛋白表達、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較對照組明顯升高，p62蛋白水平較對照組明顯下降。結(jié)果提示高濃度SDF-1可以誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬的發(fā)生。

但SDF-1對細胞自噬水平的調(diào)節(jié)并不一致，Mei等［18］通過研究發(fā)現(xiàn)SDF-1濃度與子宮內(nèi)膜的自噬水平呈負相關(guān)。Hashimoto等［19］在對胃癌細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)SDF-1可以通過使絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶（serine/threonine-specific protein kinase，AKT）磷酸化激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，導(dǎo)致MMPs的升高、細胞遷移和自噬水平的降低，并且通過予以雷帕霉素（mTOR信號通路抑制劑）可以抑制上述過程，提高胃癌細胞的自噬水平。由于自噬是一個受多種機制調(diào)節(jié)的復(fù)雜、動態(tài)的過程，造成研究結(jié)果不一致的原因可能是在不同組織細胞、不同疾病時期條件下SDF-1對自噬水平的調(diào)節(jié)會受到其他調(diào)控機制影響而變化。本研究中通過透射電鏡觀察到軟骨細胞自噬溶酶體的形態(tài)，給予100 μg/L的SDF-1重組蛋白后，軟骨細胞中自噬小體的數(shù)量較對照組明顯增多，進一步提示高濃度SDF-1能誘導(dǎo)軟骨細胞自噬的發(fā)生。

三、SDF-1可能通過調(diào)控軟骨細胞自噬參與骨性關(guān)節(jié)炎的進展

通常認為適當(dāng)?shù)淖允煽梢允辜毎m應(yīng)缺氧、應(yīng)激的外界環(huán)境而使細胞存活，但過高水平的自噬則會導(dǎo)致細胞發(fā)生自噬性死亡（即Ⅱ型程序性細胞死亡）［20，21］。同時也有研究表明早期骨性關(guān)節(jié)炎患者，尤其是接近關(guān)節(jié)面的軟骨細胞的自噬水平較正常對照組明顯升高，但隨著骨性關(guān)節(jié)炎病情進展，軟骨細胞的自噬水平則明顯降低［5］。Caramés等［22］在小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細胞的自噬水平隨著年齡的增長而逐漸降低。Almonte-Becerril等［23］認為在骨性關(guān)節(jié)炎初期，自噬表現(xiàn)為軟骨損傷的代償機制發(fā)揮保護作用，但在骨性關(guān)節(jié)炎后期可能導(dǎo)致細胞死亡而促進骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。通過分析本研究的結(jié)果，可以推測在早期軟骨損傷后，SDF-1可能通過促進軟骨細胞自噬從而抑制軟骨損傷，但高濃度的SDF-1可能會通過誘導(dǎo)軟骨細胞自噬性死亡而加重骨性關(guān)節(jié)炎的病情進展，SDF-1可能通過調(diào)節(jié)軟骨細胞自噬水平參與了骨性關(guān)節(jié)炎的進展。

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Effect of stromal derived factor-1 on autophagy level of articular chondrocyte in mice.

ZHANG Jinming，LYU Zhengtao，LU Weiwei，LI Xingyan，DONG Yonghui，QI Jun，HUANG Hui，GUO Fengjin，CHEN Anmin. Department of Orthopaedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

CHEN Anmin，E-mail:anminchen@hust.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effect of stromal derived factor-1（SDF-1）on autophagy level of articular chondrocyte in mice and to explore the effect and mechanism of SDF-1 in osteoarthritis.Methods The articular chondrocytes were obtained from 3-to 4-days-old C57BL/6 mice，cultured in vitro，and treated by recombinant SDF-1 protein for 24 h.The concentrations of SDF-1 were 0，1，10，100 and 1 000 μg/L respectively. The mRNA levels of LC3 and ULK1 were detected by the real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）.The expression levels of LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ，ULK1 and p62 proteins were examined by Western Blot.ResultsAfter chondrocytes were treated with SDF-1 of 10，100 and 1 000 μg/L，the mRNA expression levels of LC3 and ULK1 were up-regulated as compared with control group.The ratio of LC3-Ⅱto LC3-Ⅰand the expression of ULK-1 protein were increased，and the expression of p62 protein was reduced in SDF-1-treated groups（1，10，100 and 1 000 μg/L）as compared with control group（P＜0.05 for all）.Transmission electron microscopy revealed that as compared with control group，autophagic lysosomes were increased significantly after chondrocytes were treated with SDF-1（P＜0.05）.ConclusionSDF-1 can induce autophagy of articular chondrocytes in mice.SDF-1 maybe participate the progress of osteoarthritis through regulating autophagy level of articular chondrocyte.

Stromal cell-derived factor-1；Chondrocyte；Autophagy；Osteoarthritis

10.3969/j.issn.1674-8573.2016.04.011

國家自然科學(xué)基金（81472082，81572094）

430030武漢，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院骨科

陳安民，E-mail:anminchen@hust.edu.cn

（2015-12-26）