趙曉彪，李光耀，劉孟剛，范　霞，陳　平△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.肝膽外科;2.一室,重慶 400042)

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論著·基礎(chǔ)研究

大鼠Tmub1基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建*

趙曉彪1，李光耀1，劉孟剛1，范霞2，陳平1△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.肝膽外科;2.一室,重慶 400042)

目的構(gòu)建Tmub1基因的過表達(dá)慢病毒載體(LV-Tmub1)，為研究Tmub1蛋白在肝細(xì)胞增殖過程中的作用提供實(shí)驗(yàn)材料。方法化學(xué)合成Tmub1基因序列，用BamHI/AgeI酶切化學(xué)合成含有目的基因的質(zhì)粒及GV287載體，PCR產(chǎn)物連接入線性化表達(dá)的載體。PCR鑒定引物，再對(duì) PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行DNA測(cè)序和比對(duì)分析。使用構(gòu)建的LV-Tmnb1，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光法檢測(cè)構(gòu)建的慢病毒滴度。結(jié)果成功構(gòu)建了LV-Tmub1，并獲得相應(yīng)的病毒，病毒滴度為 2×108TU/mL。結(jié)論LV-Tmub1為進(jìn)一步研究Tmub1蛋白在肝細(xì)胞增殖中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Tmub1；基因；過表達(dá)慢病毒載體；大鼠

Tmub1(transmemebrance and ubiquitin-like domain containing 1) 基因編碼的Tmub1 蛋白是一個(gè)含有類似泛素結(jié)構(gòu)域的能夠在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭的蛋白質(zhì)[1-3]；在細(xì)胞周期的G0期主要位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞增殖后期的G2～S期則幾乎全部穿梭進(jìn)入肝細(xì)胞核內(nèi)。Della等[4]發(fā)現(xiàn)Tmub1蛋白在肝部分切除術(shù)后肝再生的過程中明顯高表達(dá)，它包含有一個(gè)跨膜域和一個(gè)類似泛素結(jié)構(gòu)的區(qū)域(UBL)，該區(qū)域包含與UCH、E2和CUE等的反應(yīng)位點(diǎn)。所以說明它在肝細(xì)胞增殖過程中擔(dān)負(fù)著復(fù)雜而又重要的功能。本研究構(gòu)建Tmub1過表達(dá)慢病毒載體(LV-Tmub1)，用來轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系及注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，為深入了解Tmub1 基因和蛋白在肝細(xì)胞增殖和肝再生過程中的作用及分子生物學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑Thermo Fisher Scientific Lipofectamine 2000及Opti-MEM培養(yǎng)基 ，1 kp DNA ladder Marker(Fermentas)，Gibco小牛血清，250 bp DNA ladder Marker(捷瑞生物公司)，瓊脂糖(賽百盛公司)，限制性內(nèi)切酶(NEB) ，In-Fusion?PCR Cloning (Kit clontech)， Primer(捷瑞生物公司)，Plasmid 抽提(Kit Promega)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化)，Taq polymerase(SinoBio)，dNTP(Takara) ，BRL-3A細(xì)胞(上海生命科學(xué)研究所)。

1.1.2主要儀器Applied Biosystems公司PCR儀，美季生物技術(shù)ABI3730 型positive clone 測(cè)序儀，BioRad穩(wěn)壓DNA電泳儀，天能公司凝膠成像儀，上海實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司細(xì)菌搖床，Thermo細(xì)菌培養(yǎng)箱，Gibco水浴箱，Gilson移液器，日立高速離心機(jī)。

1.2方法

1.2.1目的基因的獲取首先在美國國立圖書館查找大鼠Tmub1基因序列，基因編號(hào)：362301。PCR擴(kuò)增目的基因片段(圖1)，5′端GGA TCC為BamHI酶切位點(diǎn)，3′端ACC GGT為AgeI酶切位點(diǎn)。其中藍(lán)色標(biāo)記為美國國立圖書館的大鼠Tmub1基因編碼區(qū)。

1.2.2酶切載體工具載體購自吉?jiǎng)P基因，載體名稱：GV287；10.4 kb；元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP；克隆位點(diǎn)：BamHI/AgeI。酶切反應(yīng)溫度37 ℃，時(shí)間2 h。

1.2.3重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.3.1PCR產(chǎn)物交換入線性化表達(dá)載體反應(yīng)條件為25 ℃反應(yīng)30 min，然后42 ℃反應(yīng)15 min。

1.2.3.2CaCl2制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(1)從新鮮細(xì)菌培養(yǎng)平皿中選取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到含有 100 mL小牛血清培養(yǎng)基的1 L燒瓶中，在37 ℃條件下劇烈振蕩搖勻培養(yǎng)3 h。(2)將培養(yǎng)后的大腸埃希菌轉(zhuǎn)移到無菌的60 mL離心管中，在冰上放置10 min，4 000 r/min離心10 min，回收離心后的細(xì)胞。(3)緩慢倒出上層培養(yǎng)液，然后用10 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2重懸細(xì)胞。(4)在40 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min，回收沉淀細(xì)胞。(5)倒出培養(yǎng)液，每50 mL初始培養(yǎng)細(xì)胞用2 mL用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀。

圖1　化學(xué)合成的基因片段

1.2.3.3轉(zhuǎn)化(1)取200 μL感受態(tài)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到500 μL離心管中，管中各加入10 μL連接溶液，放置冰上30 min。(2)然后將每個(gè)離心管放到42 ℃的恒溫水浴箱中放置90 s。(3)將離心管快速放置到冰上冷卻細(xì)胞1～2 min。(3) 每管中各加入 800 μL小牛血清培養(yǎng)基，放置到37 ℃搖床上培養(yǎng)45 min。(4)分別將150 μL已轉(zhuǎn)化的各種感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到AMP抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上。(5)將平板置于室溫條件下直至液體被完全吸收。(6)倒置培養(yǎng)平皿，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

1.2.3.4陽性克隆的PCR測(cè)定采用20 μL反應(yīng)體系，取2 μL菌液作為模板，選擇合適的引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再使用瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。陽性克隆結(jié)果測(cè)序及分析。

1.2.4慢病毒包裝(1)使用2%胰酶消化培養(yǎng)于50 mL培養(yǎng)瓶中對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞密度為6×105/mL時(shí)將細(xì)胞密度重新接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察，待細(xì)胞密度達(dá)到75%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。(2)滅菌10 mL離心管中加入所制備的各DNA溶液，與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，室溫下溫育5 min。(3) 取200 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑與4.8 mL Opti-MEM培養(yǎng)基混合后在室溫下溫育 5 min。(4)將Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋后的DNA溶液與稀釋后的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑充分混合均勻，在室溫下溫育20 min。(5) 將 DNA溶液與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的混合液快速轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，充分混合均勻，放置入37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，各細(xì)胞中加入20 mL PBS緩沖液洗滌3次，然后將每瓶細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基25 mL后繼續(xù)放置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

1.2.5病毒的收獲及濃縮(1)收集轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后的 293T細(xì)胞上清液，在4 ℃，4 000 r/min條件下離心10 min后除去下層沉淀，上清液使用0.45 μm過濾器過濾于50 mL超速離心管中得到病毒提樣液。(2)將得到的病毒提液樣品加入到過濾杯中，然后將過濾杯插到濾過液收集管中，4 000 r/min離心，時(shí)間為10～15 min。(3)得到病毒濃縮液后將其分別收集于1.5 mL無菌Ep管中，-80 ℃冰箱保存，隨機(jī)取出其中一支，進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定。

1.2.6熒光法慢病毒滴度測(cè)定(1) 調(diào)整293T細(xì)胞濃度為4×105，使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，每個(gè)孔加體積為100 μL。(2)10個(gè)無菌的Ep管中分別加入90 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基。(3) 取待測(cè)定的病毒原液10 μL加入到第一個(gè)Ep管中，標(biāo)記為1管，2管中的病毒原液比1管稀釋10倍，3～10管依次稀釋10倍。(4)在96孔培養(yǎng)板中選取所需的細(xì)胞孔，吸去其中90 μL培養(yǎng)基后加入90 μL 稀釋好的病毒溶液，放入培養(yǎng)箱37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后加入完全培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)96 h后在熒光顯微鏡下觀察慢病毒熒光表達(dá)情況。

2　結(jié)　果

2.1陽性克隆結(jié)果陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小921 bp，陰性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小185 bp,見圖2。

1：陰性對(duì)照ddH2O；2：空載自連對(duì)照組；3：陽性對(duì)照GAPDH；4：Marker，自上而下依次為5.0、3.0、2.0、1.5、1.0 kb，750、500、250、100 bp；5～12：Tmub1基因1～8號(hào)轉(zhuǎn)化子。

圖2PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2陽性克隆結(jié)果測(cè)序同一性為100%，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。

2.3熒光法慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果熒光法測(cè)定慢病毒滴度為2×108TU/mL，見圖3。

A、B：加入病毒10 μL；C、D：稀釋10倍后的熒光表達(dá)情況；E、F：稀釋105倍后的熒光表達(dá)情況。

圖3熒光法慢病毒滴度測(cè)定(×100)

3　討　論

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞具有感染能力，能夠穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和原代細(xì)胞[5-8]。目前在實(shí)驗(yàn)室和臨床前研究中以及臨床治療中已廣泛使用。

肝部分切除術(shù)后，刺激體內(nèi)生物信息系統(tǒng)及物理學(xué)反饋信號(hào)系統(tǒng)使處于靜止期的肝細(xì)胞分裂，進(jìn)入增殖周期，此時(shí)體內(nèi)各種細(xì)胞因子、生物因子以及多個(gè)臟器參與其調(diào)控[9]。其中，Tmub1蛋白在肝部分切除術(shù)后的肝再生過程中明顯高表達(dá)，能夠在增殖的肝細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間穿梭，且具有明顯的生物學(xué)規(guī)律，說明Tmub1蛋白可能在肝細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用[10-11]。為了研究Tmub1蛋白在肝細(xì)胞增殖中的作用及其分子生物學(xué)機(jī)制，需要通過現(xiàn)代基因工程學(xué)的方法，構(gòu)建Tmub1基因過表達(dá)的慢病毒載體，用來轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系及注射肝部分切除術(shù)后的大鼠。首先在美國國立圖書館網(wǎng)站查到目標(biāo)基因大鼠Tmub1序列，然后通過基因擴(kuò)增技術(shù)克隆該目標(biāo)序列，再利用已有的質(zhì)粒載體，把Tmub1目標(biāo)序列整合到該質(zhì)粒中，所得到的陽性克隆序列經(jīng)過基因測(cè)序與目標(biāo)序列完全一致。再經(jīng)過滴度檢測(cè)及分裝保存，收獲了Tmub1過表達(dá)慢病毒載體。

Tmub1基因過表達(dá)慢病毒載體的成功構(gòu)建，對(duì)下一步研究Tmub1基因及蛋白在大鼠肝部分切除術(shù)后肝再生和體外BRL-3A肝細(xì)胞系增殖中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并且為了解生物體內(nèi)的其他細(xì)胞增殖的分子生物學(xué)機(jī)制提供幫助。通過對(duì)其更加深入的研究，還可能為臨床預(yù)防和治療肝切除術(shù)后肝功能衰竭提供基因治療的新思路。

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Construction of lentivirus vectors of rat Tmub1 gene overexpression*

ZhaoXiaobiao1,LiGuangyao1,LiuMenggang1,FanXia2,ChenPing1△

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery;2.DepartmentofFirstLaboratory，ResearchInstituteofSurgery，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China)

ObjectiveTo construct the lentiviral vector with overexpression Tmub1 gene to provide the experimental materials in the research of Tmub1 protein function in the process of the hepatocyte proliferation.MethodsThe Tmub1 gene sequences was constructed through chemical synthesis,plasmid containing the purpose gene and GV287 vectors were digested with BamHI/AgeI enzyme,the PCR products were connected into the linearized expression vector.PCR confirmed the primers,the positive clones identified by PCR DNA were sequenced and performed the comparative analysis.The constructed lentiviral vectors of Tmub1 gene overexpression was used to transfect 293T cell lines.Then the lentivirus titer was detected by the fluorescence method.ResultsThe lentiviral vector with Tmub1 gene overexpression was successfully constructed and the corresponding virus was obtained,the virus titer was 2×108TU/mL.ConclusionLV-Tmub1 expressing lentiviral vector provides the experimental foundations for the further study of the role of Tmub1 protein in hepatocyte proliferation.

Tmub1;gene;LV-Tmub1；rats

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.005

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81270523)。作者簡介:趙曉彪(1979-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肝切除術(shù)后肝再生的相關(guān)研究?！?/p>

，E-mail:chenping@263.com。

R575

A

1671-8348(2016)13-1744-03

2015-11-26

2015-12-30)