闕　丹，肖　何，陳　川，藍(lán)美玲，李　建，黃　環(huán)，趙蓮花，肖華亮，王　閣△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.腫瘤中心;2.病理科,重慶 400042)

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論著·臨床研究

REDE-DHPLC檢測NSCLC血漿EGFR突變及其臨床意義*

闕丹1，肖何1，陳川1，藍(lán)美玲1，李建1，黃環(huán)1，趙蓮花1，肖華亮2，王閣1△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.腫瘤中心;2.病理科,重慶 400042)

目的探討酶切富集聯(lián)合變性高效液相色譜法(REDE-DHPLC)檢測非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者外周血表皮生長因子受體(EGFR)突變的臨床應(yīng)用價值。方法采用REDE-DHPLC法對該院收治的403例NSCLC患者血漿EGFR 19和21外顯子突變狀態(tài)進(jìn)行檢測，分析突變與基線資料的相關(guān)性。其中115例患者同時采用ARMS法對腫瘤組織樣本進(jìn)行突變檢測，比較兩種方法檢測的一致性。結(jié)果403例患者血漿樣本總突變率為26.3%(106/403)。女性、不吸煙、腺癌及晚期(Ⅲb～Ⅳ)患者血漿EGFR突變率分別顯著高于男性、吸煙、非腺癌及早期患者(P<0.05)。多變量Logistic分析顯示性別、吸煙史及組織類型是血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測因素(P<0.05)。115例配對樣本中，以組織樣本為標(biāo)準(zhǔn)，REDE-DHPLC法檢測血漿EGFR突變的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為69.0%、97.3%、93.5%、84.5%，兩種檢測方法具有較好的一致性(κ=0.702)。 結(jié)論性別、吸煙史及組織類型是NSCLC患者血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測因素，REDE-DHPLC法檢測血漿EGFR突變敏感度及特異度較高。

癌，非小細(xì)胞肺；色譜法，高壓液相；酶切富集；受體，表皮生長因子

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占85%[1]，多數(shù)患者在確診時已屬晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會。以酪氨酸激酶抑制劑(TKI)為代表的靶向治療給臨床NSCLC的治療提供了新的思路，成為近年研究的熱點。組織樣本是檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但多數(shù)晚期患者常無法獲取滿意組織樣本用于突變檢測。因此，尋找更易獲取、方便動態(tài)監(jiān)測的樣本對臨床具有重要意義。近期，國內(nèi)外多項臨床研究顯示外周血EGFR突變與組織樣本具有較高的符合率[2-4]，但各檢測方法的敏感度和特異度存在一定差異，外周血樣本能否替代組織樣本用于臨床突變檢測有待進(jìn)一步研究。本研究采用酶切富集聯(lián)合變性高效液相色譜法(restriction endonuclease digestion-denaturing high performance liquid chromatography,REDE-DHPLC)對NSCLC患者血漿EGFR突變進(jìn)行檢測，分析突變與基線資料的相關(guān)性，并與配對組織樣本檢測進(jìn)行對比分析，探討REDE-DHPLC法檢測血漿EGFR突變與組織檢測的一致性。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2012年1月至2014年12月本院腫瘤中心收治的403例NSCLC患者臨床資料，其中男282例，女121例，年齡33～86歲，平均(60.5±10.0)歲。患者均經(jīng)病理確診為NSCLC。403例患者均在首次入科治療前采集空腹血漿進(jìn)行血漿突變檢測，其中115例患者在血漿檢測同時對穿刺或術(shù)后病理標(biāo)本進(jìn)行組織突變檢測(與血漿檢測時間差小于1個月)。403例患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方法403例NSCLC患者血漿EGFR 19和21外顯子突變采用REDE-DHPLC法進(jìn)行檢測，115例配對患者的組織樣本采用ARMS法進(jìn)行檢測。EGFR 19和21外顯子引物設(shè)計參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.2.1標(biāo)本收集及DNA提取患者入院后采集空腹外周靜脈血4 mL置于EDTA抗凝管中，離心后采用美國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取游離DNA。從患者石蠟標(biāo)本中獲取5片5 μm厚石蠟標(biāo)本，使用QIAGEN公司生產(chǎn)的FFEP-DNA Kit試劑盒提取組織DNA樣本。

1.2.2REDE-DHPLC法檢測血漿檢測第一輪PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括10 ×PCR緩沖液2 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、dNTP(10 μmol/μL)2 μL、上下游引物(10 μmol/μL)各1 μL、模板DNA 2 μL。PCR條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72℃ 50 s,共40個循環(huán)；72 ℃ 7 min。19外顯子為缺失突變(19 Del),將第一輪PCR產(chǎn)物加入含Mse I(美國NEB公司生產(chǎn))的酶切體系,37 ℃孵育150 min，酶切產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增體系同第一輪PCR，共40循環(huán)。產(chǎn)物采用美國Transgenomic公司生產(chǎn)的DNASep柱進(jìn)行分析。21外顯子為置換突變(21 L858R)，將第一輪PCR產(chǎn)物加入含Msc I(美國NEB公司生產(chǎn))的酶切體系，37 ℃孵育150 min，第二輪PCR產(chǎn)物采用Sau96 I酶切(美國NEB公司生產(chǎn))，而后產(chǎn)物95 ℃孵化5 min，以1 ℃/min 速度將至35 ℃進(jìn)行復(fù)性。設(shè)定DNASep柱緩沖液流速為0.9 mL/min，檢測器紫外分光光度計設(shè)為260 nm。檢測突變圖譜見圖1。

A：19外顯子缺失突變;B：21外顯子點突變。

圖1REDE-DHPLC法檢測血漿樣本19、21外顯子突變檢測結(jié)果

1.2.3組織樣本ARMS法突變檢測組織樣本DNA提取后采用ARMS法進(jìn)行突變檢測。試劑盒采用廈門艾德公司研發(fā)的人類EGFR基因突變檢測試劑盒(ADx-ARMS)，按照提供的判讀標(biāo)準(zhǔn)，對組織樣本提取的DNA突變情況進(jìn)行檢測，在本院病理科完成。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理運(yùn)用 SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗分析。基線特征與突變率的關(guān)系采用χ2檢驗及Logistic回歸分析，一致性分析采用κ檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1患者血漿EGFR突變率比較患者血漿樣本總突變率為26.3%(106/403)，其中19和21外顯子突變率分別為62.3%(66/106)和 37.7%(40/106)。

2.2血漿EGFR突變與基線特征相關(guān)性分析血漿EGFR突變與患者臨床基線特征相關(guān)性分析顯示，女性、不吸煙、腺癌及晚期(Ⅲb～Ⅳ)患者血漿EGFR突變率分別顯著高于男性、吸煙、非腺癌及早期(Ⅰa～Ⅲa)患者(P<0.05)，見表1。以單因素分析P<0.01的變量(性別、吸煙史、組織類型及分期)為自變量，以血漿突變狀態(tài)為因變量進(jìn)行Logistic多變量逐步向前回歸，結(jié)果表明，性別、吸煙史及組織類型是NSCLC患者血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測因素，見表2。

表1　患者血漿EGFR突變與基線特征的關(guān)系(n)

表2　多變量逐步Logistic回歸分析結(jié)果

2.3配對樣本一致性比較115例配對患者中，42例組織檢測結(jié)果為突變型，其中13例血漿檢測結(jié)果為野生型；31例血漿檢測結(jié)果為突變型，其中2例組織檢測結(jié)果為野生型。以組織檢測為標(biāo)準(zhǔn)，REDE-DHPLC法檢測血漿樣本的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為69.0%、97.3%、93.5%、84.5%，兩種檢測方法具有較好的一致性(κ=0.702)，見表3。

表3　兩種檢測方法一致性比較

3　討　論

大型臨床研究均表明，TKI能顯著延長EGFR突變NSCLC患者無進(jìn)展生存期，療效明顯優(yōu)于化療方案[6-7]。EGFR基因突變是患者TKI獲益的關(guān)鍵，組織樣本是突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]，但大部分NSCLC患者在確診時已進(jìn)入晚期，常無法獲得足夠組織樣本進(jìn)行突變檢測。Mok等[6]研究中僅36%患者可提供用于檢測突變的組織樣本，這導(dǎo)致組織樣本突變檢測在臨床應(yīng)用中受到一定限制。外周血循環(huán)腫瘤DNA主要來源于凋亡壞死和脫落的腫瘤細(xì)胞，其遺傳特性與腫瘤細(xì)胞基因組DNA相同[2]，這為血漿樣本用于EGFR突變檢測提供了可行性。此外，外周血檢測還具有易獲取、創(chuàng)傷小、患者易接受、方便動態(tài)檢測等特點，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

目前，應(yīng)用于血漿EGFR突變檢測的方法包括ARMS法、PCR限制性片段長度多態(tài)性分析法、突變富集型PCR、DHPLC法、微數(shù)字PCR、熒光定量PCR等[9]。由于納入患者樣本量及基線特征的差異、血樣本采集時間的不同、檢測方法靈敏度差異等，各檢測方法與組織樣本檢測的一致性為48.2%～92.0%[3-6]。部分方法對儀器和操作要求較高、檢測成本高、操作復(fù)雜，臨床廣泛推廣仍存在一定困難。DHPLC法具有操作簡單、快速、自動化程度高等優(yōu)點，目前已在臨床EGFR突變檢測中開展應(yīng)用，Bai等[5]報道DHPLC法檢測血漿EGFR突變的檢測限值約為3%。楊卓等[10]采用REDE-DHPLC法對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品EGFR突變進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其檢測限值達(dá)到0.1%，顯著高于傳統(tǒng)DHPLC法。本研究結(jié)果中，患者血漿樣本總突變率為26.3%(106/403)，其中19和21外顯子突變率分別為62.3%(66/106)和37.7%(40/106)，與既往報道基本一致[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，女性、非吸煙者、肺腺癌及亞洲人種是組織EGFR突變的高發(fā)對象[9]。本研究對血漿樣本突變分析發(fā)現(xiàn)性別、吸煙史及組織類型是患者血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測因素，可作為初步判斷患者潛在突變的因素。

115例配對樣本中，以組織檢測為標(biāo)準(zhǔn)，REDE-DHPLC法檢測血漿樣本的敏感度和特異度分別為69.0%和97.3%，兩種方法具有較好的一致性。在42例組織突變樣本中，有13例血漿檢測為野生型?？紤]主要與檢測方法靈敏度相關(guān)。Liu等[11]采用直接測序法檢測患者血漿EGFR突變發(fā)現(xiàn)，突變率僅為5.1%，遠(yuǎn)低于組織樣本檢測結(jié)果。而采用敏感性更高的ARMS法重新檢測發(fā)現(xiàn)，5例血漿直接測序法陰性患者ARMS法檢測為陽性。Rosell等[12]發(fā)現(xiàn)，晚期NSCLC患者和低分化癌患者，血漿突變檢出率更高，與組織樣本檢測具有更高一致性，這可能與晚期患者腫瘤負(fù)荷較大、低分化腫瘤侵襲性強(qiáng)，更易血性轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示腫瘤負(fù)荷與血漿突變檢出率具有相關(guān)性。微數(shù)字PCR法是以單分子反應(yīng)為基礎(chǔ)的極高選擇性檢測方法，該技術(shù)能夠較易實現(xiàn)對單個分子的檢測，Yung等[13]報道其檢測準(zhǔn)確度高達(dá)99%以上，但在對12例組織直接測序法檢測突變陽性患者的血漿應(yīng)用微數(shù)字PCR檢測時仍有1例患者血漿檢測陰性，推測腫瘤異質(zhì)性可能是影響檢測結(jié)果的因素之一。本研究中，3例組織19 Del患者血漿檢測為21 L858R，5例組織21 L858R患者血漿檢測為19 Del，可能與腫瘤自身內(nèi)部、原發(fā)灶與外周血液間等存在異質(zhì)性相關(guān)。本研究中，2例(2.7%)組織檢測陰性患者血漿檢測為突變陽性，這與Li等[14]的報道類似，其研究中4例(80%)組織檢測陰性而血漿陽性患者服用TKI后療效較差，提示該血漿檢測陽性結(jié)果可能為假陽性。

REDE-DHPLC具有快速、經(jīng)濟(jì)、自動化程度高、可高通量檢測等優(yōu)點，與組織EGFR突變檢測結(jié)果具有較高一致性，可作為臨床血漿EGFR突變檢測有效方法。

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Detect of plasma EGFR mutations in NSCLC by REDE-DHPLC method and its clinical significance*

QueDan1,XiaoHe1,ChenChuan1,LanMeiling1,LiJian1,HuangHuan1,ZhaoLianhua1,XiaoHualiang2,WangGe1△

(1.TumorCenter;2.DepartmentofPathology，ResearchInstituteofFieldSurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

ObjectiveTo investigate the clinical application value of peripheral blood epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in non-small cell lung cancer (NSCLC) detected by the restriction endonuclease digestion combine with denaturing high performance liquid chromatography (REDE-DHPLC).MethodsFour hundred and three patients with NSCLC in our department were detected plasma EGFR mutations for exons 19 and 21 by the REDE-DHPLC method.The relationships of EGFR mutations with the patients′ clinical characteristics at baseline were analyzed.Among 403 patients,115 cases were detected EGFR mutations in tumor tissue by simultaneously adopting the ARMS method.The consistency of the two methods was compared.ResultsThe total activating mutation rate of EGFR was 26.3 %( 106/403) in plasma.The mutation rate in female,non-smoking,adenocarcinoma and stage ⅢB-Ⅳ were significantly higher than that in men,smoking,non-adenocarcinoma and stage ⅠA-ⅢA(P<0.05).The multivariate Logistic analysis results showed that gender,smoking history and histological types were the independent predictors of EGFR mutations in plasma(P<0.05).In the 115 matched samples,taking the tissue samples as standards,the sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of the REDE-DHPLC for detecting EGFR mutation were 69.0%,97.3%,93.5% and 84.5% respectively.The two detection methods had better consistency(κ=0.702,P<0.01).ConclusionGender,smoking history and histological types are the independent predictors of plasma EGFR mutation.REDE-DHPLC has higher sensitivity and higher specificity for detecting plasma EGFR mutation.

carcinoma,non-small-cell lung;chromatography,high pressure liguid;enzyme digestion enrichment;receptor,epidermal growth factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.013

吳階平基金資助項目(320.6750.12228；320.6750.12177)。作者簡介：闕丹(1988-)，在讀碩士研究生，醫(yī)師，主要從事肺癌靶向治療方面研究?！?/p>

，Tel:(023)68757617;E-mail:wangge70@hotmail.com。

R734.2

A

1671-8348(2016)13-1767-03

2015-11-21

2016-01-16)